تحتاج بعض الكائنات المتطفلة على النبات مثل بعض الفطريات والفيروسات وأيضا النيماتودا إلى وجود العائل النباتي وليس هنالك سبيل لإكثارها معملياً على البيئات الصناعية كغيرها من الكائنات الأخرى. وهنا تظهر أهمية تقنيات زراعة الأنسجة في إكثار مثل هذه الكائنات بغرض إجراء الدراسات المختلفة فيما يتعلق بعلاقة الكائن المرضي بالعائل مما يسهل سبل مكافحة هذه المتطفلات وأيضا يسهل اختبارات التقييم خلال برامج التربية للنباتات المقاومة للأمراض والآفات المختلفة

 (Kikkert et al., 1967, and Butcher 1980.)

1- إكثار النيماتودا في زراعة الأنسجة

إن معظم النياتودا النباتية تتغذي وتتكاثر في الجموع الجذري للعائل ويمكن اكثارها في الصوبات والمعامل باستخدام عائل نباتي ملائم ينمو في التربة. وهذه الطريقة قد تتطلب ضرورة توفير صوبات ملائمة وتجهيز تربة نظيفة خالية من المسببات المرضية الأخرى، هذا بالإضافة إلى صعوبة عزل هذه النيماتودا بطريقة مثالية.

إن الاتجاه نحو إكثار النيماتودا باستخدام الأنسجة النباتية المعزولة من النبات مثل الجذر والكالوس حققت أولى نجاحاتها عام1954(Mountain, 1954)  عندما استخدم هذا العالم جذور الذرة والدخان في اكثار النيماتودا Pratylenchus minyus وبهذه الطريقة يمكن دراسة دورة حياة النيماتودا بدقة في وسط معقم خال من المكونات الميكروبية الأخرى وقد استمر نموها لمدة أربعة أسابيع مع ملاحظة تجديد البيئة Subculture كل أسبوعين وقد أمكن أيضاً الحصول على أعلى عدد من النيماتودا خلال ثلاثة أشهر عند درجة ٢٥ م، لكن من ناحية أخرى فقد لوحظ أن بعض أنواع النيماتودا الأخرى يمكن أن تؤدي إلى تدهور في مزارع الكالوس حيث توقف انقسام الخلايا النباتية ويمكن أن يتحول النسيج إلى اللون الأصفر ثم الأسود ويموت كما هو الحال في نيماتودا Pratylenchus penetrans.

وتتميز طريقة استخدام الخلايا والأنسجة في إكثار النيماتودا بسهولتها مع إمكانية إكثارها في فترة قصيرة كما أنها تعتبر طريقة تطبيقية لإنتاج نيماتودا تعقد الجذور Meloidogyne spp وهي جيدة بصفة عامة في أجناس آخري من النيماتودا.

تتميز مزارع الجذور بخواص عديدة تجعلها جذابة لاستخدامها في بحوث العلاقة بين العائل والطفيل:

1- تتميز بمعدل عال للنمو وفي نفس الوقت إنتاج نموات ثانوية كمصدر لا ينضب لمادة تجريبية متماثلة ونعني الجذور الثانوية التي تتكون من الجذور الأصلية المنزرعة.

2- الجذور المعزولة تنمو تحت ظروف معقمة وظروف بيئية متحكم فيها وفي غياب الملوثات الميكروبية.

3- تنمو هذه الجذور في بيئة تتكون من مركبات بسيطة وهي غير معقدة التركيب

كذلك تبقى على الشكل المورفولوجي لها كما لو كانت متصلة بالنبات وهذا ما يجعلها مناسبة تماماً لدراسة ميكانيكية العدوى بالكائنات الممرضة للجذور (Butcher, 1980 and Jones, 1980)

ومع ذلك فإن هذه الطريقة لم تستخدم على نطاق واسع حتى الآن. وقد يرجع ذلك إلى صعوبة عزل أنواع من الجذور النباتية بصورة حية أو أن هذه الكائنات من النوع facultative pathogen وتؤدي إلى تدمير مزرعة الجذور (Jones ,1980)

2- اكثار الفيروس

وضع العالم Kikkert وآخرون عام ۱۹۹۷ نظاماً وبروتوكولا لدراسة فيروس الطماطم  tomato spotted wilt virusفي البروتوبلاست لنبات الطماطم باستخدام مادة polyethylene glycol مع عدوى الفيروس بسلالة قوية. وجد أن 50 ٪ من خلايا بروتوبلاست الدخان كانت مصابة كما امكن تحديد وجود الحمض النووي الفيروسي كذلك بروتين الفيروس المصنع بعد العدوى ب16 ساعة وبعد 90 ساعة امكن استخدام اختبارImmuno-cytology  حيث تراكم كميات كافية من جزيئات الفيروس. وقد أكدت الدراسات الأخرى مثل استخدام الميكروسكوب الإلكتروني وعدوى العوائل المتخصصة إنتاج هذا الفيروس في الخلايا وأن دورة تضاعف الفيروس قد اكتملت. وقد وجد أن محاولات عدوى بروتوبلاست اللوبيا بنفس الفيروس أعطت نتائج أقل بالمقارنة بخلايا الدخان Kikkert, et al.1997.

امكن إصابة البروتوبلاست المعزول من ميزوفيل أوراق الدخان بواسطة فيروس TMV وهو تبرقش الدخان وقد حدث تضاعف لجزيئات الفيروس عند إعادة زراعة البروتوبلاست في بيئة سائلة جديدة ووصل التركيز الأعلى لجزيئات الفيروس بعد ٢٢ ساعة وقد استخدم اختبار صبغة الفلورسنت فوجد أن 3-7٪ من البروتوبلاست كانت مصابة بالفيروس (Aoki and Takebe, 1969).

امكن الحصول على نباتات كاملة من بروتوبلاست أوراق الدخان المصابة بفيروس PVX وأيضا درس تأثير مادة الفيروزول المضادة لتضاعف هذا الفيروس (Shepard, 1977).

أشار واتس (1980 .Watts et al) إلى إمكانية عدوى وتضاعف أكثر من فيروس واحد داخل البروتوبلاست مما يشير إلى إمكانية دراسة تأثير هذه الفيروسات المختلفة داخل نفس الخلية.

3- اكثار الفطريات .

أشار العالم Ingram إلى إمكانية نمو الكائنات الدقيقة إجبارية التطفل في مزارع الكالوس للعائل النباتي الخاص بالطفيل وقد أكد على أهمية ذلك للحفاظ على سلالات نقية ومعرفة للطفيل هذا بالإضافة إلى ضمان نقل الطفيليات خلال مراكز البحوث في الدول المختلفة بأمان تام بدلاً من نقل العوائل المصابة نفسها

(1980 ,Ingram . 1980, Jones).

جدول يوضح الفطريات التي أمكن إنماؤها بنجاح في العوائل النباتية (1980,Ingram)

وتفيد هذه الطرق في دراسة العلاقة بين الكائن والطفيل على المستوى المعملي المتحكم به مما يؤدي إلى زيادة فهم عديد من طرق وأساليب التطفل وبالتالي الوصول إلى أفضل السبل للمكافحة، انظر الجدول السابق.

وتتلخص الطريقة في خطوات أساسية:

1- إنشاء مزرعة كالوس صحية وقوية من نسيج العائل على بيئة ملائمة في فلاسكات أو أطباق بتري وتحضن على درجة حرارة ملائمة في الظلام.

2- لكي يتم نمو الفطر علي بادرات من العائل النباتي لصنف حساس يجب تعقيم البادرة النامية وقد يتأتى ذلك بتعقيم البذور النامية وإنباتها في جو معقم ثم عدوى البادرات بجراثيم الفطر من السلالة المطلوبة وبعد إتمام العدوى غالبا بعد 72 ساعة من الحقن يتم أخذ قطع من أوراق البادرة المصابة ووضعها على كالوس النبات الذى أعد في بيئة زراعة الأنسجة الملائمة.

ومما هو جدير بالذكر أنه ليس جميع الفطريات الإجبارية التطفل يمكن نموها في مزارع الكالوس وقد ذكر كثير من المحاولات الفاشلة وقد يرجع إلى إفراز الفطر لسموم Aflatoxin في البيئة أو لسرعة نمو الفطر بمعدل أكبر من النسيج النباتي أو أن ظروف التحضين لا تلائم نمو الفطر والنسيج النباتي في نفس الوقت أو غير ذلك من الأسباب غير المعروفة (Buczacki, 1980, and Jones, 1980)

مواضيع ذات صلة

تقانة زراعة الجذور الشعرية Hairy root culture

زراعة الأنسجة النباتية وتقاناتها المختلفة

زراعة البروتوبلاست Protoplast Culture

زراعة الخلايا النباتية

زراعة المياسم وحبوب اللقاح

مراحل التكاثر الخضري الدقيق

مزايا التكاثر الخضري الدقيق

تجذير النموات الخضرية في البيت الزجاجي مباشرة

بعض المصطلحات الأساسية والمهمة في زراعة الأنسجة النباتية

إنتاج سلالات متباينة وراثيا بزراعة الكالوس

الهرمونات النباتية ودورها في زراعة الأنسجة النباتية

المعوقات الفيزيولوجية في التكاثر الخضري الدقيق