الأوكسينات Auxins ودورها في زراعة الأنسجة

تستعمل الأوكسينات بصورة كبيرة في مزارع الأنسجة فربما لا تخلو طريقة إكثار نبات ما على الاقل في إحدى مراحل الإكثار من أحد الأوكسينات. وكلمة أوكسين Auxin مشتقة من الكلمة اليونانية Auxein والتي تعنى النمو، وذلك لتأثيره الواضح في نمو النباتات واستطالتها. وهذه المجموعة من منظمات النمو يتم تخليقها حيويا في القمم النامية للنبات ثم تتحرك حركة قطبية لباقي الأجزاء. ويطلق على الهرمون اسم اكسين لو كان له القدرة على التحكم في عمليات محددة من النمو والتكشف كانقسام واستطالة الخلايا (2004 ,Cleland)، كما تتحكم الأوكسينات في السيادة القمية وعمليات الانتحاء الضوئي. وفي مزارع الأنسجة يترتب على ذلك نشوء القمم الميرستيمية التي يمكن أن تتكشف إلى أعضاء نباتية أو كالوس وتمتاز الأوكسينات الطبيعية والمخلقة بوزنها الجزيئي المنخفض واحتوائها على حلقة اندول أو حلقة عطرية. وهي عبارة عن بلورات تذوب بدرجة خفيفة في الماء لكنها تذوب جيدا في المذيبات العضوية كالميثانول والإيثانول والاسيتون أو في الأحماض والقلويات الضعيفة ويرجع اكتشاف الأوكسينات إلى العالم Went في سنة 1926 وبعد الإشارة الأولية لتلك المركبات التي تسبب إنحناء غمد ريشة الشوفان نحو الضوء على يد Boysen-Jensen في عام 1910 توالت الأبحاث نحو عزل هذه المادة وتعريفها محاولة ايجاد مشابهات معملية لها. وقد عرف أثر ذلك أن هذا المادة عبارة عن بلورات بيضاء اطلق عليها أندول حامض الخليك IAA ويتم تصنيعه من الحامض الأميني التربتوفان (2004 ,.Manly et al) كما هو موضح في شكل رقم (1).

ويتم ذلك في القمم النامية لكل من المجموع الخضري والجذري كذلك البراعم الطرفية والبراعم الزهرية والأوراق حديثة التكوين وأعناقها. لكن على العكس من اشارة العديد من الدراسات إلى تخليق IAA في القمم النامية يعتقد (2000) Baker أن القمم النامية هي مكان لتجميع IAA الذي يخلق في الأوراق البالغة. وأمكن التعرف على بعض المركبات الطبيعية التي لها تأثير مشابه لأندول حامض الخليك مثل فينايل حامض الخليك. وحيث أنتخليق IAA داخل النبات يتم من حامض التربتوفان فإن هذا الحامض يلعب دوراً مشابها للأوكسين في بعض مزارع الأنسجة.

ويتوقف تركيز IAA في المُستأصل النباتي على تركيزه في النبات الأصل وعمرها وموسم النمو وظروف النمو المختلفة. وفى الأنسجة المتكشفة تلعب الأوكسينات دورا محوريا في السيادة القمية والتي يجب كسرها في بعض أنواع مزارع الأنسجة. ويعتبر (2004) Davies من أفضل المراجع من حيث تاريخ اكتشاف منظمات النمو ودورها في النبات بشكل عام. تستخدم الأوكسينات في تشجيع نمو الكالس والخلايا في المعلق الخلوي وكذلك الأعضاء في مزارع الأنسجة كما تعمل على تنظيم عمليات التكشف وخاصة عند إضافتها مع السيتوكينينات. حيث تستحث الأوكسينات انقسام الخلايا وبدء تكوين مراكز ميرستيمة في مزارع الأنسجة والتي يمكن تكشفها فيما بعد (Razdan (2002. ووجود تلك المناطق الميرستيمية يشجع من سرعة النمو باعتبار أن هذه المناطق مراكز لتصنيع IAA ، لدرجة أن بعض الأنسجة والأعضاء المنزرعة يمكنها النمو دون إضافة اكسين خارجي اعتمادا على مقدرتها على تصنيعه ذاتياً وتسمى الأنسجة auxin habituated أي ذاتية الأوكسين.

شكل 1 : مراحل التخليق الحيوي لأندول حامض الخليك (2004 ,Davies).

كذلك تبرز أهمية الأوكسين في مراحل تكوين الجذور على النباتات المتكشفة في مزارع الأنسجة، لكن لابد من تحديد توقيت المعاملة فاستحثات تكوين الجذور يتم في وجود الأوكسين لكن ربما يتطلب الأمر إزالة الأوكسين كليا أو خفض تركيزه في بيئة نمو الجذور (1987 Pierik). وتتوقف نوعية الأوكسينات المضافة وكذلك تركيزها على النوع النباتي ونوع النسيج ومحتواه الطبيعي من الأوكسين وقدرة هذا الجزء على تصنيع الأوكسين، وبالطبع يعتبر نوع النمو والتكشف المراد إحداثه عاملاً محدداً لنوع وتركيز الأوكسينات المضافة للمزرعة. وسيتم الاعتماد في دراسة دور الأوكسينات في مزارع الأنسجة على (2008) .Machkova et al والذي قام بتقديم عرض موسع جدا عن الدراسات السابقة في هذا الصدد.

الأوكسينات المصنعة معملياً

على العكس من الأوكسينات المخلقة التي تتسم بالثبات يحدث تكسير سريع لـ IAA الطبيعي المضاف إلى وسط النمو وكذلك داخل الأنسجة المنزرعة عقب امتصاصه. وربما يكون هذا الهدم سواء داخل الأنسجة أو بالانخفاض التدريجي للتركيز في الوسط الخارجي ضرورياً لإحداث التكشف في حد ذاته، ويفسر ذلك باختلاف تأثير الأوكسين على المراحل المختلفة أثناء التكشف لذا قد ينصح بإضافة IAA مع أحد الأوكسينات المصنعة للحصول على نتائج أفضل. وهناك العديد من المركبات المصنعة معمليا تحاكي الأثر الوظيفي لـ IAA، وأكثر الأوكسينات المصنعة والمستعملة في زراعة الأنسجة هي (D-2،4) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid- والذي شاع استخدامه في إنتاج الكالس والمعلق الخلوي لفترات طويلة، لكن قل استعماله حديثاً بعد اكتشاف شدة التغيرات الوراثية التي يسببها وحل محله مركبي (3-indolebutyric acid (IBA و (1-naphthalene acetic acid (NAA وهناك بعض الأوكسينات الأقل استخداما في مزارع الأنسجة مثل chlorophenoxy acetic acid or p- chlorophenoxy acetic-4 (acid (4-CPA و (2-naphthyloxyacetic acid (NOA كما يندر استعمال مركب (T -2,4,6) trichlorophenoxy acetic acid-2,46 ويقتصر استخدامه على إنتاج الكالس والتكشف غير المباشر للأجنة الجسدية في النباتات أحادية الفلقة كالأرز. ومن الأوكسينات المصنعة أيضاً مركب 3,6-dichloroasic acid (Dicamba) والذي يستعمل غالباً لإنتاج الكالس المكون لأجنة جسدية في النباتات أحادية الفلقة، وقد يؤدى نفس الدور في النباتات ثنائية الفلقة أيضاً.

ويجب الإشارة إلى أن التركيزات العالية نسبياً من معظم الأوكسينات على وجه الخصوص Dicamba 2,4-D و T-2,4,5 و amino-3,5,6-trichloropcolinic-4 (methyl-4- chlorophenoxyacetic acid (MCPA) acid (Picloram-2 لها سمية حيوية خصوصاً للنباتات ذات الأوراق العريضة ولهذا السبب يستعمل بعضها كمبيدات حشائش. وهناك أنواع أخرى من مشابهات الأوكسينات لكنها لا تستعمل في زراعة الأنسجة مثل CDPPN ويشير (2003) .Tadino et al إلى كفاءة بعض المركبات الحديثة مثل 2,4-D و  3-(benzo[ꞵ]selenyl) acetic acid) (BSSA)في مزارع الأنسجة وتكوين الأجنة الجسدية وهذا ما أكده (2002) .Kevers et al في مزارع أنسجة نباتات Panax ginseng. ويوضح شكل رقم (2) بعض الأوكسينات الشائع استعمالها.

شكل 2: بعض الأوكسينات المصنعة معمليا والمستعملة في زراعة الأنسجة.

ثبات الأوكسينات في مزارع الأنسجة

على العكس من باقي الأوكسينات يتصف IAA و IBA بالحساسية للحرارة والتحلل الجزيء عند التعقيم الحرارى. ولا يتوقف الأمر عند ذلك حيث يعتبر IAA غير ثابت في المزرعة حتى لو تم إضافته بعد تعقيم البيئة بالترشيح، وينخفض تركيزه في بيئة MS بمقدار 90% بعد أربعة أسابيع في الظلام وبدون وضع أي أنسجة في البيئة. ويزيد تركيز الأملاح والضوء من سرعة التحلل كما يزيد معدل الهدم في البيئة السائلة بالمقارنة مع الشبه صلبة. وفي قياس لبيئة MS السائلة على درجة حرارة 25 م و 8/16 ساعة ضوء/ ظلام سجل انخفاض في تركيز IAA من 1.72 ملجم/لتر إلى أقل من 0.05 ملجم/ لتر بعد 14 يوم من الزراعة (1988 Nissen & Suite). أما IBA فكان أكثر ثباتاً من IAA وانخفض تركيزه إلى 75% فقط بعد 30 يوم في الظلام و 40% بعد 30 تحت ظروف الإضاءة السابقة. ويعتبر كلا من NAA و 2,4-D من أكثر الأوكسينات يوم ثباتاً في بيئات زراعة الأنسجة، لكنهما يرتباطان مع مركبات أخرى وكذلك يتحللان نتيجة الفعل الأنزيمي داخل الأنسجة المنزرعة بمجرد امتصاصها.

النشاط الوظيفي للأكسينات

تتباين الأوكسينات في نشاطها الوظيفي بالإضافة إلى درجة تحركها داخل الأنسجة وارتباطها مع المركبات الأخرى وكذلك تحللها بالإنزيمات النباتية. وبناءً على ذلك فإن النوع المستعمل منها وتركيزه الفعال يتم تحديده اعتماداً على التركيب الوراثي ونوع وحجم المُستأصل النباتي ومرحلة زراعة الأنسجة. ويلاحظ ارتفاع تركيز الأوكسينات في كامبيوم النباتات المعمرة في بداية الربيع حيث تنشط البراعم في التخليق الحيوي للأكسينات (2001 ,.Funada et al) وربما يكون التركيز الداخلي كافيا لتكوين الكالس دون أي اضافة خارجية لمنظمات النمو. وبالرغم من أن الأوكسينات المصنعة متاحة ومستخدمة كبديل لـ IAA من عدة سنوات إلا أنه مازال من غير المعلوم مدى تشابه الفعل الوظيفي لتلك الأوكسينات مع IAA أو مدى تحويرها لفعله الوظيفي في الأنسجة. ففي كثير من التطبيقات العملية للأكسينات خصوصاً لإنتاج الجذور يتم خلط أكثر من أكسين واحد كذلك وجد (2003) .Przew et al أن خلط الأوكسينات أكثر فاعليه في تكوين الأشطاء لنباتات القمح والتريتيكال والشعير. لكن نظر الان تأثير كل نوع يعتمد على الطراز الوراثي فإنه يفضل استعمال نوع واحد فقط منها. ويكون خلط IAA مع أحد الأوكسينات المصنعة أفضل من استعمال الأوكسينات المصنعة بمفردها. ويمتص الأوكسين عند الرقم الهيدروجيني 5-6 في صورة جزيئات كاملة، وبعد الامتصاص تهدم داخل الخلايا ببعض الإنزيمات المتخصصة.

تأثير الأوكسينات في زراعة الأنسجة

يعمل الأوكسين بصورة عامة على الإسراع من نمو الأنسجة بتمدد وانقسام الخلايا ويتم ذلك طبقا لنظريتين هما:

1. ضخ أيون الهيدروجين خلال جدر الخلايا حيث يعمل ارتباط الأوكسين بجدر الخلايا على تكسير اللبيدات المكونة لها. وبذلك تزداد حموضة الجدار وتزداد مطاطية جدر الخلايا ومعدل امتصاص أيون البوتاسيوم إلى الخلايا لمعادلة أيون الهيدروجين. يترتب على هذا خفض الضغط الاسموزي للخلية وزيادة قدرتها على امتصاص الماء ومن ثم تتمدد ويؤدى خروج أيون الهيدروجين إلى زيادة حموضة الوسط الخارجي وتنشيط التبادل الأيوني. وبهذه الطريقة يعمل الأوكسين بطريقة غير مباشرة على استحثاث تصنيع إنزيم ATPse الموجود في الغشاء الخلوي والمسئول عن نقل أيونات الهيدروجين والهيدروكسيل من وإلى الخلية فتزيد نفاذية الجدر للأيونات الأخرى. وهذه النظرية تعد أكثر النظريات قبولاً لتفسير النمو السريع الحادث للخلايا عند إضافة الأوكسين.

2. أما النظرية الثانية فتفترض أن الأوكسينات تساعد على زيادة معدل تصنيع الأحماض النووية mRNA. وبالتالي زيادة معدل تصنيع أنواع محددة من البروتينيات التي تشجع استطالة الخلايا وانقسامها وقد أمكن تحديد العديد من الجينات التي ينشط تعبيرها الجيني بفعل IAA كروتين Aux/IAAS. وعلى سبيل المثال عند إضافة الكلورومنينيكول إلى بيئة نمو مزارع أنسجة نبات الدخان لوحظ انخفاض أو عدم تأثير IAA وكذلك الأحماض النووية المسئولة عن تصنيع إنزيم ꞵ-1,3-glucanase الذي يعمل على التحلل المائي لمركب ꞵ- 1,3-glucanpolysaccharides-1,3 في الجدر الخلوية فيؤدى ذلك إلى زيادة مرونتها ومطاطيتها. تؤدى المعاملة بالأوكسين أيضا إلى إنتاج جزينات سكر Oligosaccharides النشطة حيوياً.

أما تأثير الأوكسينات على عمليات التكشف في مزارع الأنسجة فترتبط بنوع النسيج ومدى حساسيته للأوكسين. ويبدو أن الأوكسينات قادرة على تنشيط المعلومات الوراثية والفسيولوجية بجينوم الخلية والتي تقود إلى عمليات التكشف. لكن تظل ميكانيكية عمل الأوكسين في التكشف غير معروفة بالتفصيل حتى الآن. لكن لوحظ أن المعاملة بالأوكسينات تزيد من ارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي، وقد يكون ذلك مهما لإعادة برمجة الخلية وتحويلها من الحالة غير المتكشفة إلى الحالة المتكشفة حيث استخلصوا في دراستهم المرجعية الدور الكبير لميثلة الحامض النووي في عمليات التكشف في مزارع الأنسجة وتأثير ذلك على عدد وتطور الخلايا الميرستيمية في الأعضاء المختلفة تحكمها في التعبير الجيني. ولقد أصبح من المقبول الآن القول إن عبر ميثلة الحامض النووي هي التي تتحكم في عملية التكشف عبر مجموعة من الجينات الخاصة بالتحكم في نوعية النسيج. لكن وجد (2004) .Dunja et al أن معدل ارتباط مجاميع الميثيل بالحامض النووي أثناء المراحل الأولى لتكوين الأجنة الجسدية لا ترتبط بوجود الأوكسين في البيئة، وقد انخفض هذا المعدل في مرحلة نضج الأجنة بصرف النظر عن وجود الأوكسين. لكن تؤدى الزيادة الكبيرة في تركيز الأوكسين المضاف إلى زيادة الخلل الوراثي في الخلية والمتعلق بارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي مما يؤدى إلى استبعادها من التكشف. ولتحديد التركيز والنوع المناسب من الأوكسينات لمزارع الأنسجة لا بد أن يؤخذ في الاعتبار نوع النمو والتطور المستهدف من المزرعة ومعدل امتصاص وانتقال الأوكسين ويلعب التركيز الداخلي من الأوكسينات في النسيج النباتي أهمية كبرى في تحديد التركيز الأنسب الذي يجب اضافته للبيئة. وبالإضافة إلى ذلك فإن عمليات تثبيط فعل الأوكسين سواء في البيئة أو بعد امتصاصها في النسيج كالأكسدة والارتباط تؤثر في النشاط الحيوي للاكسين. وقد أشار (Davies, 2004a) إلى اختلاف النشاط الحيوي للأكسين ليس فقط باختلاف النوع النباتي بل من خلية إلى أخرى وكذلك تبعاً للحالة الفسيولوجية للخلية نفسها ولعل ذلك يشير إلى أهمية تحديد الحالة الفسيولوجية للنبات الأم المستخدم كمصدر للمستأصل النباتي فمن الطبيعي أن تختلف الحالة الفسيولوجية للنبات باختلاف فصول السنة وعمليات الخدمة المختلفة، وسيتم توضيح ذلك بالباب التالي.

ويمتاز التأثير الحيوي للأوكسينات بشكل الجرس حيث يزيد التأثير برفع التركيز في مدى يتراوح غالباً بين 0.1 و 10 مكرومول ثم يصبح التأثير سلبي ويرجع ذلك لزيادة تخليق الإثيلين. ويرتبط فعل الأوكسين في مزارع الأنسجة بنوع وتركيز منظمات النمو الأخرى، لكن قد تمثل كل مزرعة حالة فريدة من حيث استجابتها للاكسين وربما لا تتحقق نفس النتيجة لو حدث تغيير بسيط في العوامل الأخرى. وبشكل عام تستعمل الأنواع المختلفة من الأوكسينات في زراعة الأنسجة بتركيزات متباينة لتحقيق أحد الأهداف الآتية:

1 . تكوين الكالس والتكشف

تعمل الأوكسينات على زيادة معدل ارتباط مجموعات الميثيل بالأحماض النووية وبالتالي ترتد الخلية من الحالة المتكشفة إلى الحالة الميرستيمية وتأخذ في الانقسام وتكوين الكالس. ويشير (1990) Terzi & Lo Schiavo إلى أن زيادة ارتباط مجموعات الميثيل بالأحماض النووية عن مستوى معين تدفع الخلايا للدخول في حالة التكشف وتكوين أعضاء أو أجنة جسدية مرة أخرى (2004) .Leljak-Levanie et al. وبالرغم من التأثير الشديد لـ D-2,4 على التغييرات الوراثية فإنه قد يستخدم في بداية زراعة العديد من النباتات بتركيز منخفض في مدى 3-1 ملجم/ لتر لدفع تكوين الكالس الذي ينقل لاحقا

إلى بيئة تحتوي على نوع اخر من الأوكسينات. ويكثر الآن استعمال NAA, IAA وبتركيز عالي نسبياً يصل إلى 10 - 20 ملجم/ لتر لنباتات الفلقة الواحدة وبعض النباتات من ذات الفلقتين. لكن يجب إضافة بعض السيتوكينينات إلى البيئة مع الأوكسينات لإنتاج الكالس، على الرغم من أن وجود السيتوكينينات ليس ضرورياً لتكوين الكالس. وتعمل الأوكسينات على تفكك الخلايا وانخفاض معدل التكشف في المعلق الخلوي على العكس من السيتوكينينات التي تعمل على بدء تخليق الكلوروفيل في الكالسات والمعلق الخلوي ثم الدخول في مرحلة التكشف لكن ربما يشجع تركيز الأوكسينات العالي في المعلق الخلوي تكوين الأجنة الجسدية، إذا كانت الخلايا تمتلك القدرة الوراثية لذلك.

تؤكد العديد من النظريات دور الأوكسينات في تكوين مبادئ الأوراق، حيث يستطيع IAA تغيير الخواص التركيبية للجدار الخلوي وتوجيه الألياف الدقيقة المكونة ربما من خلال تخليق بعض البروتينات الخاصة بذلك، وأمكن دراسة ذلك من خلال دراسة التكشف في بعض طفرات الارابدوبسس (2001 ,Francis & Sorrell). ويتطلب إحداث التكشف في مزارع الأنسجة حدوث اتزان بين كلا من الأوكسينات السيتوكينينات، وعندما تكون هذه النسبة منخفضة فإنه يتوقع حدوث تكشف للأشطاء وعند النسبة المرتفعة يتوقع تكشف الجذور. وغالباً تستخدم بيئة محتوية على الأوكسينات فقط في المرحلة التالية لاستطالة الأفرع لدفعها للتجذير قبل نقلها إلى خارج المعمل (شكل التالي). ويعتبر IBA أكثر الأوكسينات استخداما لتكوين الجذور على العقل وأشار (1992) .Van der Krieken et al إلى تحول IBA إلى IAA عقب امتصاصه، لكن لا يعني ذلك عدم تأثيره في صورته الأصلية. وعلى العكس من السيتوكينينات فإن الأوكسينات في مزارع القوارير تثبط تصنيع الكلوروفيل في العديد من النباتات، وتعمل مضادات نقل الأوكسين على زيادة تخليق الكلوروفيل (2000 ,Singh& Syamal). لكن التركيز المنخفض جدا والذي يصل إلى 20 % عن ذلك المستعمل في إنتاج الكالس قد يشجع تخليق الكلوروفيل.

تتكون الجذور الجانبية من منطقة البريسيكل الملاصق للخشب الأولى وتتحكم الأوكسينات في عدد الجذور التي تتكشف على المُستأصل النباتي. كما أن التحرك القطبي للأكسين (2003 ,Friml) من الأشطاء إلى الجذور يشير إلى أن انتقال وتراكم الأوكسين إلى البريسيكل هو الذي ينشط انقسام الخلايا ومن ثم تكشف الجذور. لكن يعتبر مسار الأوكسين في الجذور من العمليات المعقدة والتي تثير الكثير من الجدل حيث يشير البعض إلى أن الأوكسينات ربما تتحرك في اتجاه محدد في أحد الأنسجة بينما تتحرك في الاتجاه المضاد في نسيج آخر. وهذا لا يضعف نظرية دور الأوكسينات في نشؤ الجذور لكنها توضح أن هذه الاشارة أكثر تعقيداً مما يعتقد. وبالفعل تم الحصول على طفرة من نباتات ارابدوبسس يطلق عليها alf1 لها القدرة على تخليق كميات عالية من IAA وتميزت تلك النباتات بالقدرة على تكوين الجذور الجانبية. أما نباتات الطفرة 1-alf4 والتي تعاني من نقص IAA فلم تكون جذور جانبية إلا بعد المعاملة بهذا الهرمون، ويرجع ذلك لدور الهرمون في استحثاث انقسام الخلايا في طبقة البريسيكل (1995 ,.(Celenza et al لكن تشير هذه الدراسة أيضاً إلى أن تطور تلك المنشأت الأولى خلال طبقة القشرة يقع تحت تحكم آلية أخرى.

2. تكوين الأجنة الجسدية

لكن هناك عدد من التجارب التي كانت الاستجابة فيها لا تتطابق مع هذه الفرضية حيث تم استحثاث الخلايا لتكوين الأجنة في بيئة غير محتوية على الأوكسينات، وعلل ذلك بارتفاع محتوى الأنسجة من الأوكسين الطبيعي. ويستمر انقسام الخلايا ونمو الأجنة بعد ذلك متلازما مع الانخفاض الطبيعي في تركيز الأوكسين والراجع إلى تحلله أو ارتباطه مع مركبات أخرى. لكن سجل (2002) .Bozhko et al موت للخلايا وزيادة في درجة حموضة المزرعة عند استبعاد الأوكسين بغرض دفع نمو الأجنة الجسدية لنباتات Picea abies.

وباكتشاف تحكم الرقم الهيدروجيني للبيئة في تكوين الأجنة الجسدية لنباتات الجزر، أرجع البعض مثل (2002) .Pasternak et al تأثير الأوكسينات في تكوين الأجنة الجسدية ولو جزئيا إلى تأثيرها على الرقم الهيدروجيني للجدر الخلوية. لكن يتلازم تطور الأجنة مع إزالة الأوكسين من البيئة ورفع الرقم الهيدروجيني. كما وجد أن الأجنة الجسدية تتكون في البيئات ذات الضغط الأسموزي العالي فالبيئات المحتوية على 0.7 مليمول من السكر أو 0.06 مليمول من المانتول أو 0.3 مليمول من كلوريد الصوديوم تشجع تكوين الأجنة الجسدية في الجزر. كذلك فإن التعرض لأيونات المعادن الثقيلة على سبيل المثال 5.0 - 0. 1 مليمول من الكادميوم يشجع تكوين الأجنة وبالطبع لا يرجع ذلك إلى تأثيره على الرقم الهيدروجيني. وهناك تداخل واضح بين تركيز السكر والأوكسينات التي من شأنها استحثاث الخلايا لتكوين أجنة جسدية (1988 ,.Lazzeri et al). وربما تعمل الأوكسينات المضافة للبيئة على استحثاث فعل IAA الداخلي لتكون الإشارة الأولى لدفع الخلية لتكوين الأجنة الجسدية (2002) .Thomas et al. وقد نجح .We et al (2009) في تحديد ثمان جينات تلعب دور في تكشف الأجنة الجسدية منها Aux/IAA المسئول عن تكوين بعض البروتينات الخاصة باستحثاث تكوين الأجنة الجسدية في كالوسات القطن. ومن هذا العرض السريع لإمكانية استحثاث تكوين الأجنة الجسدية يمكن القول إن ميكانيكية الاستحثاث وفعل الأوكسينات للأجنة الجسدية غير معروفة بشكل تام ولا تتوقف فقط على الرقم الهيدروجيني. وربما تعمل بعض العوامل البيئية بطريقة مباشرة أو غير مباشرة على التأثير على الفعل الأوكسيني.

3. مزارع الأعضاء

من المؤكد أن الأوكسينات ضرورية لتشجيع نمو القمم الميرستيمية ومزارع القمم النامية على الرغم من السيادة القمية التي تمتاز بها الأوكسينات. ولذا يجب خفض تركيز الأوكسينات لزيادة معدل تكوين الأفرع دون تكوين الكالس في المرحلة التالية لنمو هذه الأجزاء. لكن تظل هناك أهمية لتحديد نوعية وتركيز الأوكسين المضاف وارتباط ذلك بالنوع النباتي، وتركيز السيتوكينينات المضافة. وتلعب الأوكسينات دورا هاما في مزارع الجذور واستحثاث تكوين الجذور الجانبية (الشكل التالي). وتعتبر التركيزات المنخفضة من الأوكسينات هي الفعالة في استحثاث نشوء الجذور على النباتات في مزارع الأنسجة. ويرجع تثبيط تكوين الجذور عند استعمال التركيز العالي منها إلى زيادة تركيز الإثيلين في الخلايا المعاملة بالأوكسينات خاصة تلك المصنعة له ,.Ali et al (2008 و (2002 ,Cooke). وقد يتطلب الأمر معاملة قواعد أفرع نباتات Juniperus phoenicea النامية في مزارع الأنسجة بتركيز منخفض للغاية (2.5 ميكرمول) ولمدة خمس دقائق فقط قبل زراعتها في البيئة لإستحثاث تكوين الجذور على 40% من النباتات بينما نجح 6% فقط من الأفرع التي زرعت في بيئة محتوية على نفس التركيز في تكوين جذور (2007 .Louriro et al) . ومن المعاملات التي تشجع تكوين الجذور على النباتات اعادة زراعتها في البيئة عدة مرات وخفض شدة الإضاءة لتنشيط ما يعرف بالاستطالة الإظلامية وكذلك اضافة بيئة سائلة فوق البيئة الصلبة (2002 ,De Klerk)

شكل يبين : استطالة الأشطاء العرضية وتكوين الجذور لنباتات Capsicum annuum في بيئة MS تحتوى على 2 ملجم/ لتر IBA (يمين) وتقزم الأشطاء وعدم تكوين الجذور في بيئة تحتوى على سيتوكينينات فقط (يسار).

تنظيم نشاط الأوكسين

لا يتوقف نمو وانقسام وتكشف الخلايا في مزارع الأنسجة على تركيز الأوكسينات المضافة للبيئة فقط، لكنه يعتمد أيضاً على التركيز الداخلي لـ IAA والتداخل بينهما وكذلك على العوامل المؤثرة على ثبات الأخير. ونشاط IAA الداخلي مهم في التحكم في النمو والتكشف فقد وجد أن النباتات التي تعاني من نقص عنصر البورون بها نقص في IAA حيث لا يصنع RNA المسئول عنه ولا يتم الانتقال الطبيعي لـIAA داخل النبات وينخفض معدل استجابة هذه النباتات للمعاملة بالأوكسين وبالتالي فإن استعمال أنسجة من نباتات تعانى من نقص البورون يتطلب استعمال تركيزات أعلى من الأوكسينات من الثابت أن IAA حساس للحرارة ويحدث له تكسير جزئي بالتعقيم الحراري، بالإضافة إلى تأثره بالضوء. لكن حتى بفرض التعقيم بالترشيح فإن الـ IAA لا يعتبر نشط جدا كأوكسين خارجي لتشجيع عمليات النمو والتكشف بسبب تكسيره في النبات، فبعد 8 ساعات من إضافته لمعلق خلايا الجزر يكون 20% فقط من الممتص منه في صوره حرة و 45% في صورة مرتبطة مع حامض الأسبرتك والنسبة الباقية تتكسر لمركبات أخرى.

وتتفاعل كلا من الأوكسينات الطبيعية والمصنعة مع بعض المركبات داخل الخلايا كما تلتصق مع بعض الجزيئات الصغيرة وتكون ما يسمى بالأوكسينات المرتبطة conjugation كذلك ترتبط مع بعض البروتينات وتكون معقد وبذلك يثبط فعل الأوكسين مؤقتاً. أيضا تتكون معقدات أخرى باتحاد IAA مع بعض المركبات مثل الاسترات، والجليكوسيدات والأحماض الأمينية. ويبدو أن هذه ميكانيكية فسيولوجية لحفظ مستوى IAA داخل الخلايا. فبتحلل هذه المركبات أنزيميا يتحرر الأوكسين ليعاود نشاطه مرة أخرى، وبذلك تمثل هذه المعقدات حماية للأكسين من عمليات الأكسدة. وللمزيد عن آلية عمل وأيض الأوكسينات من هذا المنطلق يمكن الرجوع إلى (2008) .Bertos et al و (2005) Woodward & Bartel. وقد تختلف نسبة الأوكسين المرتبط بين الطرز الوراثية المتباينة، كذلك فإن طبيعة المعقدات المتكونة تتوقف على الأنواع النباتية. كما تتحلل الأوكسينات المضافة خارجياً جزئياً وتثبط داخل الخلايا، فمثلا يحدث إحلال لذرات الكلور الموجودة في جزء 2,4-D المضاف إلى معلق خلايا القمح بمجموعات هيدوكسيل ثم يرتبط المركب الناتج مع السكر لينتج مركب غير نشط كأوكسين، لكن لو ارتبط المركب الناتج مع حامض أميني فإنه يكون نشط فسيولوجياً . ينخفض مستوى الأوكسين الحر داخل الأنسجة بسرعة عند المعاملة باكسين خارجي كذلك فإن عمليات غسيل النسيج النباتي قد تقلل مستواه. وبنقص مستوى الأوكسين الخارجي يتم تحال المعقدات المتكونة من الأوكسين والمركبات الأخرى للحفاظ على مستواه الداخلي. ولكي يقوم الأوكسين بدوره على الأقل في تنظيم بعض العمليات الحيوية فلابد أن يرتبط بمواقع بروتينية في الخلية ووجود هذه المواقع المستقبلة للأكسين هام لإحداث الفعل الأوكسيني (2005 ,Woodward). وقد يكون أحد أدوار هذه المستقبلات هو تمرير الأوكسين في الأغشية الخلوية وجعله قادرا على التحرك في السيتوبلازم.

أيض الأوكسين في مزارع الأنسجة

تمتص الأنسجة الأوكسينات المضافة للبيئة بسرعة في صورة جزئيات كاملة عند رقم هيدروجيني أقل من 6. ويرتبط تركيز الـ IAA الداخلي بمعدل التخليق الحيوي له وأكسدة IAA IBA و indole-3-propionic acid (IPA) إلى مركبات غير فعالة بواسطة إنزيمات البيروكسيدز. وبذلك تلعب تلك الإنزيمات دوراً محورياً في ضبط مستوى الأوكسين داخل الخلايا. وتوجد هذه الإنزيمات طبيعيا بصور تسمى (isoenzymes) داخل خلايا الأنسجة المنزرعة لكنها تتباين بشدة بين الأنواع النباتية، كما يتأثر تركيزها بعدة عوامل أهمها تركيز الهرمونات المضافة للبيئة. ومما لا شك فيه أن هذه الإنزيمات تؤثر على النمو والتكشف بتأثيرها على تركيز الهرمونات الداخلية. وقد أشارت عدة دراسات إلى دور أنزيم peroxidase في المراحل المختلفة لتجذير النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة، ويتوقف تركيز peroxidase في الأنسجة المنزرعة على نوع الأوكسين المضاف. وتوضح نتائج (2000) . Saxena et alالخاصة بتجذير نباتات Plumbago zeylanica هذا التباين خلال مراحل مختلفة من الزراعة. ولاحظ أن التباين في تركيز الإنزيم نتيجة المعاملة بتركيزات مختلفة الأوكسينات كان أشد تأثرا بـ IAA أو IBA عن المعاملة بـ NAA أو 2,4-D.

كما سبق القول يؤثر التركيز الداخلي للإثيلين في أنسجة النبات والذي يرتبط بدوره بالعديد من العوامل الخاصة بزراعة الأنسجة، على معدل التصنيع الحيوي للأوكسين. وتؤدى المعاملات التي تسبب تغيير في التركيز الداخلي للإثيلين في كالوس بعض الأنواع النباتية إلى تأثير شديد في معدل تكوين وتطور الأجنة الجسدية. حيث ثبط تكوين الأجنة الجسدية في الأوعية محكمة الغلق بسبب زيادة تركيز الإثيلين. وكذلك أدت المعاملة بتركيز 0.01 - 1.00 ملجم/ لتر من الإثيفون إلى استحثاث تكوين الأجنة الجسدية، ويلاحظ أن مستوى الإثيلين في هذه الحالة كان أقل من تركيزه عند إحكام غلق الأوعية المستعملة للزراعة. وأيضا تثبط المعاملة بالجلاكتوز التخليق الحيوي للأكسين عن طريق رفع مستوى الإثيلين الداخلي. ومن ناحية أخرى ينظم معدل أكسدة الـ IAA ببعض الإنزيمات مثل IAA-oxidase وتوجد كمية كبيرة نسبياً من المثبطات الطبيعية التي تمنع أكسدة IAA بفعل هذا الانزيم في القمم الميرستيمية للأنسجة التي في حالة الصبا عنها في الأنسجة البالغة إلا إذا حدث لها جرح. والمسلك الطبيعي لتثبيط هذه المركبات هو وجود المواد المختزلة حيث تعمل المواد المختزلة مثل NADH والتي تحفظ الخلية في حالة جهد اختزالي منخفض على تثبيط أكسدة IAA. وبالتالي تلعب مثبطات الأكسدة دوراً هاماً في انقسام الخلايا وتكشفها.

دور المركبات الفينولية في النشاط الأوكسيني

يطلق على المركبات التي تحمل واحدا أو أكثر من مجموعات الهيدروكسيل في حلقة عطرية مشتقات الفينول وقد تكون في صوره أحادية أو ثنائية أو ثلاثية الكربوكسيل. وهناك العديد من الأبحاث التي تشير إلى دور تلك المركبات في تنظيم النمو في مزارع الأنسجة (2009 ,.Sharifian et al). وتوجد هذه المركبات بصورة طبيعية في النباتات حيث تعمل ومشابهتها المصنعة معمليا كعامل مختزل بصورة عامة في الخلايا. بذلك يمكن أن تعتبر كعامل مختزل للأنزيمات المؤكسدة لـ IAA مما يفسر نشاطها كمنظم للنمو عندما تضاف إلى بيئة مزارع الأنسجة لأنها تحمى الأوكسين من الأكسدة. وقد وجد في بعض التجارب أن المركبات الفينولية تشجع نمو الكالس وتكشف المزيد من الأشطاء بالإضافة إلى تحسن واضح في تجذير الأشطاء المتكشفة. لكن يتوقف ذلك على تركيز الفينولات فنباتات Eucalyptus tereticornis المتكشفة من مستأصلات نباتية تم جمعها في الفترة من شهر يوليو إلى سبتمبر كانت ذات مقدرة أعلى على التجذير عن تلك التي جمعت في باقي شهور السنة وقد لاحظ (1995) Das &Mitra أن ذلك يرجع إلى انخفاض محتوى النباتات من الفينولات في الفترة من يوليو إلى سبتمبر. وقد أظهرت دراسة (2009) .Rustaei et al تشابه تأثير بعض الفينولات مع الأوكسينات وبالذات IAA، فعند إضافة 162 ملجم/ لتر من phloroglucinol إلى بيئة نمو التفاح زاد معدل تكوين الأفرع الجانبية. وكذلك حفز (2000) Te-Chato &Lime تكوين الجذور على نباتات Garcinia mangostana باستعمال 34.5 ميكرومول من المركب السابق. ويبدو أن هذه المواد تحاكي فعل الأوكسين عن طريق المواد الناتجة من أكسدتها مثل phloroglucinol و phloridzin. وقد استخلصت نظرية أن وجود إنزيم polyphenoloxida المؤكسد للفينول يشجع التجذير بأكسدة الفينولات. كما يعمل كلا المركبين على تثبيط ظاهرة التميز الزجاجي لكونهما بادئ لتصنيع اللجنين. كذلك وجد (2002) Hoque &Arima أن phloroglucinol تحفز كالوس Trapa japonica على التكشف.

يتضح مما سبق أن معدل تصنيع الفينولات الداخلية في الأنسجة المنزرعة يؤثر على معدل النمو والتكشف في زراعة الأنسجة بتأثيره على مستوى ونسبة الأوكسينات إلى السيتوكينينات الداخلية، وبصفة عامة يعتبر وجود الفينولات متلازماً مع درجة التكشف. وتجدر الإشارة إلى أن الأنسجة في مرحلة الصبا تحتوى على نسبة عالية من المواد الحامية للأكسين من الأكسدة على العكس من الأنسجة البالغة وقد يفسر هذا استجابة الأنسجة في حالة الصبا لزراعة الأنسجة بالمقارنة مع الأنسجة البالغة. وتقترح بعض الملاحظات على المستوى الطبيعي للمواد الحافظة للأكسين أن مستوى هذه المواد يكون منخفضاً في مرحلة بدء تكوين الجذور ثم يرتفع في مرحلة نمو الجذور. وذلك لأن التركيزات المرتفعة من الأوكسينات لازمة لبدء تكوين الجذور بينما يحتاج نمو الجذور إلى تركيز أقل. وقد لوحظت أهمية انخفاض تركيز IAA في البيئة أو في المُستأصل النباتي في بعض عمليات التكشف فقد أكد (1997) .Guan et al احتياج العقل الدقيقة للتفاح في مرحلة تكوين الجذور لتركيز مرتفع في البداية ثم تركيز منخفض لتشجيع نموهما عقب ذلك. فيعتقد أن الأفرع النامية في المعمل تحتوي على تركيز منخفض من الفينول في مرحلة بدء تكوين الجذور ومستوى أعلى أثناء نمو الجذر. ويلاحظ انخفاض مستوى الفينول عند نقل النباتات إلى بيئة نمو الجذور مع زيادة نشاط إنزيم البيروكسديز. أدت المعاملة ببعض المشابهات الفينولية مثل catecholy , phloridzin إلى المحافظة على التركيز الداخلي من IAA تحت ظروف الإضاءة العالية. وقد وجد -Ascencio (2008) .Cabral et al أن اضافة 3 جم / لتر من phloridzin إلى بيئة إنبات الأجنة الجسدية لنباتات Carica papaya تمنع التميز الزجاجي للنباتات وترفع نسبة الإنبات لزيادة معدل تخليق اللجنين.

وهناك العديد من المركبات الأخرى التي تصنف ضمن الفينولات مثل coumarins ولها تأثيرات فسيولوجية في بعض العمليات الحيوية كتصنيع البروتين والكربوهيدرات، والتنفس، والفسفرة الضوئية لكن تظل ميكانيكية عملها غير واضحة على وجه الدقة. وبإضافة تركيزات منخفضة من هذه المركبات يتضح تأثيرها الإيجابي في مزارع الأنسجة بتأثيرها المعاون لـ IAA ، أما التركيزات العالية منها فهي منشطة لأنزيمات الأكسدة. وقد لاحظ (2002 ,.Nandi et al) أن كلا من IBA و coumarin تشجع تكوين الجذور على عقل Cedrus deodara . وشجعت إضافة tyrosine إلى بيئة كالوس نخاع الدخان عملية التكشف وفسر ذلك بأن بعض الإنزيمات تحوله إلى coumarins الذي يعمل بدوره على حفظ IAA من الأكسدة (2004 ,.Tartoura et al)

تأثير الأوكسينات الخارجية ومضادات الأوكسينات على مستوى IAA

ربما تعمل الأوكسينات المصنعة عند إضافتها إلى مزارع الأنسجة على المحافظة على مستوى الـ IAA الداخلي بمنع أكسدته، أو بتثبيط فعل إنزيم IAA oxidase. وقد فسر تثبيط 2,4-D للتكشف في بعض المزارع إلى النقص المتزايد في نشاط IAA-oxidase عند تعرض الأنسجة لـ 2,4-D لمدة طويلة. ويسترد المُستأصل النباتي قدرته على التكشف بنقله إلى وسط خالي أو منخفض التركيز من الأوكسينات لزيادة تركيز الإنزيم فيحدث التكشف وتكوين الأشطاء من المعروف أن الأوكسينات هي المجموعة الوحيدة من منظمات النمو التي تتحرك داخل النبات بنظام قطبي من القمم النامية إلى أسفل. كما تنتقل الأوكسينات لمسافات بعيدة عبر الأوعية الناقلة (اللحاء غالبا). وتحتفظ الخلايا بمنحنى تركيز للرقم الهيدروجيني عبر الغشاء البلازمي ويكون الجدار الخلوي أكثر حامضية من السيتوبلازم مما يمكن IAA الذي يوجد في الوسط الحامضي في صورة غير مرتبطة من دخول الخلية بالانتشار عبر السيتوبلازم. أما في الوسط القلوي فيحدث تأين للمعقدات المحتوية على IAA ويتحرر ليمر عبر الغشاء خلوي. لكن الحركة إلى خارج الخلية لا تتم إلا إذا التصق IAA مع جزيء حامل، وترجع الحركة القطبية لوجود هذا الحامل في قاع الخلية.

واستعمل البعض مجموعة من المركبات أطلق عليها مضادات الأوكسين وهذه المركبات تعمل على إيقاف حركة الأوكسين داخل النبات المعامل أو الأنسجة المنزعة، لكن ميكانيكية عمل تلك المركبات معقدة وغير معروفة بالتحديد. ومن هذه المركبات مركب (2,3,5-tri-iodobenzoic acid (TIBA والمركب المعروف بـ 3-Phenyl thioacetic acid (PTAA) (1,2,4-thiodiazol-5yl) وكذلك (N-1- Naphthaylphthalamic acid (naptalam or NPA (الشكل التالي). ويجب التنويه إلى عدم صحة تسمية كل تلك المركبات بمضادات الأوكسين حيث أنها لا تنافس الأوكسين في الارتباط بمستقبلاته في الخلية لكنها تضاد انتقال الأوكسين. فتقوم هذه المركبات بالارتباط بالحامل الناقل لـ IAA مما يمنعه من الارتباط بالأوكسين فيعيق حركته إلى خارج الخلية، وتم فعلا تحديد بعض هذه المواقع. ففي خلايا الدخان حدد موقعين أحدهما خاص للارتباط بالأوكسين والآخر من الممكن أن يرتبط بالأوكسين أو naptalam أي هناك علاقة تنافسية بين الأوكسين ومضاد الأوكسين في الارتباط بالحامل. لكن لو كان الفعل المثبط لمضادات الأوكسينات يتوقف فقط على نقل الأوكسين في الجدر الخلوية فإنه من المتوقع أن يزيد كلا المركبين في النسيج المعامل بهما، وهذا غير مطابق للنتائج حيث يزيد TIBA امتصاص IAA في المعلق الخلوي خاصة في الوسط الحامضي وما زال الفعل الحقيقي لمضادات الأوكسينات غير معروف بدقة (2008 ,.Machakova et al).

شكل يبين : التركيب الكيميائي لبعض مضادات الأوكسينات

وقد أظهرت مضادات الأوكسينات مثل B-NAA, phenyl peropionic acid و TIBA أثرا فعالا في بعض مزارع الأنسجة وبخاصة في عمليات التكشف عند إضافتها لبيئة الزراعة (2004 ,.Zhang et al). فتركيز 50 ملجم/لتر من naptalam منع نمو كالوس الدخان وشجع تكشف الأشطاء في وجود IAA. ويبدو أنه يشجع تكوين السيتوكينين أو يقلل من نشاط الأوكسين حيث أن الكالس الذي زرع في بيئة محتوية على 0.4 ملجم من الكينيتين و 50 ملجم/ لتر naptalam كون أشطاء ، لكن عند إزالته من البيئة لم تتكشف الأشطاء. وكذلك فإن (p-chlorophenoxyisobutyric acid (PCIB يعيق الفعل التثبيطي لـ 2,4-D في تكشف الأشطاء. وقد تحتوى بعض الأنواع النباتية على تركيز عالي من الأوكسين الداخلي الأمر الذى يكون غير مناسب لتكوين البراعم العرضية، وبإضافة تركيز منخفض في حدود 0.01 - 0.1 ملجم/لتر من TIBA تكشفت أشطاء في مزارع أنسجة نبات Pelargonium ، كما وجد Kaparakis &Alderson (2003) أن TIBA ينشط تكوين الكالس لنباتات Capsicum. وربما عملت مضادات الأوكسين في هذه الدراسة على عدم انتقاله إلى أماكن التكشف فزادت نسبة السيتوكينينات إلى الأوكسينات مما شجع التكشف أيضاً تؤثر مضادات الأوكسينات ومضادات انتقالها على عملية تكوين الجذور فقد ثبط TIBA تكوين الجذور على عقل السويقة الجنينية العليا للطماطم (2004 Tyburski & Trety). واستعمل TIBA بتركيز 1 ملجم/لتر بإضافة نقطتين منه فوق قمم الأفرع النامية من الورد كبديل لقرط القمم النامية لتشجع نمو الأفرع الجانبية. أما إضافته بتركيز 3 ملجم/ لتر فشجعت إنتاج الأشطاء في مزارع هجن الورد (1988 ,Voyiatzi & Voiatzi). واستخدمت مضادات الأوكسين أيضاً في تكوين الأجنة الجسدية في مزارع متك الشعير والذرة وكان لـ TIBA تأثير أفضل من بعض الأوكسينات في إنتاج كالوس ذو مقدرة على إنتاج أجنة جسدية.

لاحظ (2000) .Nakano et al انخفاض معدل تكشف كالوسات نباتات Lilium formosanuma بتقدم عمر المزرعة وبالتحديد بعد 72 شهر من التأسيس حيث كان معدل تكشف البراعم العرضية من قطع الكالس هو 10% فقط وكان معدل تكوين الأشطاء أقل من فرع واحد لكل قطعة كالوس. ولاستعادة قدرة الكالس على التكشف تم إضافة عدة منظمات النمو إلى البيئة وهي NAA و PIC و TBA و (benzylaminopurine (BA or BAP و -5-N-phenyl-N-1,2,3-thiadiazol (ylurea (Thidiazuron or TDZ وكان المركب الوحيد الذى له قدره على استحثاث التكشف من الكالس هو TIBA . ومن ثم تم إضافته بعدة تركيزات إلى بيئة التكشف في وجود TDZ, BA وتوضح النتائج المبينة في الجدول رقم التالي، ارتفاع نسبة التكشف وعدد الأشطاء الناتجة من الكالس عند إضافة TIBA إلى بيئة النمو. كذلك كان هناك تداخل بين السيتوكينينات المستعملة و TIBA مع عدم التأثير على حيوية الكالس. وأمكن التغلب على عدم تكوين جذور على بعض الأشطاء المتكشفة في هذه البيئة بزراعتها مرتين في بيئة خالية من منظمات النمو. ومن هذا يتضح أن الانخفاض في معدل التكشف بتقدم عمر المزرعة قد يرجع إلى عوامل فسيولوجية خاصة بالأوكسينات حيث أمكن استعادتها بمثبطات نقل الأوكسين وليس لتراكم التغييرات الوراثية كما يفترض كثير من الباحثين. لكن لم يكن لنفس المركب دوراً في استعادة القدرة على تكوين أجنة جسدية والتي يفترض أنها تعتمد على توزيع محدد للأبوكسين داخل الكالس المنزرع وليس تثبيط حركته كليا.

جدول يبين: تأثير TDZ و BA و TIBA على تكشف الأشطاء والأجنة الجسدية من کالوس Lilium formosanuma عمر 2 شهر (2000 ,.Nakano et al).