نمـــو الاحياء المجهريــة

عمليات نمو الاحياء المجهرية تختلف باختلاف الظروف التي توجد فيها الاحياء كما انها تختلف بالنسبة للأحياء وحيدات الخلية ومتعددة الخلايا. والنمو يعرف على انه الزيادة الرتيبة لكل مكونات الكائن الحي. فالأحياء التي تنمى في المختبر يختلف نموها في البيئات الطبيعية والتي تميل فيها للعيش بشكل جوقة او مجموعة Consortia مع احياء اخرى وفيها تختلف الصفات الفسلجية والشكلية الخارجية لتساهم في الحفاظ على الأحياء الحية وعليه فأن الفعاليات الحيوية في المجمعات تختلف تماماً عن تصرفات وفعالية الخلية المفردة. وسيتم في هذا الجزء مناقشة نمو وتكاثر الاحياء من الناحية النظرية لاحياء وحيدات الخلية مثل البكتريا تحت الظروف المختبرية المثلى لتكون منطلقا للتحويرات التي يمكن ان تحدث تحت ظروف اخرى.

وللنمو مؤشرات منها النمو على مستوى حجم الخلية والذي يكون مسيطرا عليه وراثيا ويمكن ان يكون عرضة للتغير تحت الظروف المختلفة، اما المؤشر الاخر وهو الزيادة في الوزن والمؤشر الاخر هو الزيادة في العدد، والاخير يعد مهما جدا في الاحياء وحيدات الخلايا، وذلك لان في الخلية الواحدة يلاحظ ان المساحة السطحية تتناسب طرديا مع مربع نصف القطر (في الاحياء الكروية والاسطوانية او العصوية) بينما يتناسب الحجم مع مكعب نصف القطر، ولذلك يلاحظ ان ازدياد حجم الخلية بشكل مضطرد يجعل النسبة بين المساحة السطحية والحجم مختلة، ولان المكونات الخلوية تحتاج الى مصادر طاقة إدامة تأتي من خارج الخلايا بالاعتماد على المساحة السطحية وكذلك الحال من طرح الفضلات، ولذلك عندما تصل النسبة الى قيمة حرجة فأنه لابد من انقسام الخلايا، وهذه الظاهرة قد تعالج في الاحياء العصوية او الاسطوانية بشكل آني بتكوين الخيوط وعليه فان مؤشر النمو العددي هو الاكثر أهمية في الاحياء المجهرية وحيدات الخلية.

النمو في البكتريا

انقـــــــــسام الخلية : تتكاثر البكتريا بصورة عامة بالانشطار الثنائي، بعد ان تكون الخلايا قد استطالت او وصلت القطر المقرر والذي يكون كافيا لإعطاء خليتين. وتحدث هذه بعد تضاعف المادة النووية التي توزع على الخلايا الجديدة وتنقسم الخلايا بتكوين الغشاء الخلوي والجدار الخلوي الى الداخل بمساعدة الأجسام الوسطية الغشائية. والبكتريا تنقصها خيوط الانقسام المغزلية لذلك يقوم الغشاء بمهمة توزيع المكونات النووية وذلك لان التراكيب النووية متصلة بالغشاء على الاقل قبيل عملية الانقسام. فبعد تضاعف DNA تتحفز عمليات تخليق الغشاء الخلوي بين مواقع اتصال الكروموسومات الشقيقة بالغشاء، ثم تتباعد بعد نمو الغشاء في تلك المنطقة ويلي ذلك ترسب مواد الجدار الجديدة وتؤدي الى الاستطالة وبالنهاية تضاعف غلاف الخلية الخارجي.

تجمـــــــــع الخلايا : في بعض الأحيان تبقى الخلايا متصلة مع بعضها بشكل مؤقت بعد الانقسام مما يؤدي الى ظهور الخلايا بتجمعات خاصة وبعض الأحيان مميزة للجنس. والتجمعات الظاهرة تعتمد على مستويات الانقسام وعدد الانقسامات مثل انتاج التجمع المسبحي في الكروية Streptococci وفي العصوية Steptobacteria او Streptobacilli. ويمكن ان تحصل حركة للخلايا بعد الانقسام مباشرة تؤدي الى جلب الخلايا بوضع متوازي مؤدية الى تكوين تراكيب وتدية Palisade التي تكون مميزة لبكتريا الخناق Cory. diphtheriae.

وفي المزارع القديمة لبعض البكتريا التي اعطيت فيها انظمة الانقسام تظهر فيها اشكال غير منتظمة Involution forms وتشمل تكوين الخيوط او البراعم او تكوين خلايا متفرعة وأغلب هذه الخلايا لا تكون حية.

نمو المجموع البكتيري

يوجد عدد من الطرق لقياس نمو الخلايا بعضها مباشرة واخرى غير مباشرة ولكل من الطرق محاسن ومساوئ، وتعد طريقة تحديد العدد العيوشي Viable count هي الطريقة المرجعية على الاقل في المختبر وفيه يقاس عدد الخلايا الحية التي تكون قادرة على انقسام وتكون المستعمرات وبذلك تكون طريقة غير مباشرة واهم اهداف قياس نمو المجموع البكتيري هو تحديد منحني النمو الذي يكون بمثابة مصدر ملائما للعديد من المعلومات.

منحنى النمــــــــــــو : يتم رسم وقياس منحنى النمو عادة في مزارع سائلة مغلقة مثل استعمال الدوارق الزجاجية والتي تحدث فيها تبادل الغازات فقط، ويتم عند الظروف المثلى من حيث توفر المواد الغذائية بكميات كافية واستعمال المزارع المهزوزة لغرض التخلص من البيئات الموضعية ودرجة حرارة ملائمة، وكذلك البدأ بأعداد كبيرة تتراوح بين 10³ –10⁴ خلية او  وحدة تكوين المستعمرات / مللتر لتلافي الزحام الذي يؤدي الى تغير نمط الفعاليات الحيوية للخلايا. ويتم تلقيح الوسط الغذائي الجديد من مزروع قد نمي مسبقا لحد التشبع وبمتابعة النمو ينتج الشكل الموضع الآتي (شكل 1) .

ويلاحظ ان المنحني ينقسم الى اربعة مراحل رئيسة يتخللها دورين انتقالية. وهذه الاطوار هي التطبع او التلكؤ (A) Lag phase والطور التزايدي او الطور اللوغاريتمي (C) Log phase وطور الاستقرار او الثبات (E) Stationary phase، والطور الرابع هو طور الانحدار او الموت (F) Death phase.

وهنالك طور انتقالي هو طور التعجيل (B) Acceleration phase والذي يقع بين الطور الأول اي طور التطبع وطور النمو المتزايد، والطور الانتقالي آخر هو الذي يقع في نهاية طور النمو المتزايد وطور الاستقرار ويسمى طور التباطؤ (D) Deceleration phase.

شكل 1 : منحني نمو أحياء وحيدة الخلية (بكتريا) في مزارع سائلة مغلقة

طور التطبع

ويسمى خطا بطور التلكؤ وذلك لان التلكؤ في هذه الحالة يكون مستوى المؤشر العددي للنمو، اما على مستوى الفعاليات والتخليق فتكون على اوجها، اذ تحدث عمليات الكبح Repression للعديد من المسارات الايضية المستعملة في البيئة السابقة قبل ان توضع الخلايا في البيئة الجديدة، اضافة الى ان الخلايا تقوم بحث مسارات ايضية جديدة تلائم البيئة الجديدة وقد يستغرق الطور مددا مختلفة قد تصل اضعاف وقت الجيل للخلايا وذلك اعتمادا على عدد من الظروف :

1- الحالة الفسلجية للخلايا وتأريخها قبل بدء عملية التنمية، فالخلايا المأخوذة من مزارع قديمة تكون اعداد الخلايا الحية فيها اقل من المزارع الفتية، لذلك فان الخلايا الحية تحتاج الى وقت لتصل الاعداد التي يمكن التحسس بها وتسجيلها، كما ان الخلايا المأخوذة من بيئات قاسية والتي حدث ضرر في موادها الوراثية بشكل خاص وموادها الخلوية بشكل عام تحتاج الى وقت قبل البدء، إذ ان نقاط السيطرة Check points في الخلية تمنع عملية الانقسام قبل ان يحدث اصلاح تام لموادها الوراثية. كما إن الخلايا المكونة للأبواغ وكثرتها في اللقاح يؤدي الى اطالة الطور، اذ تحدث فيها عمليات الانبات قبل ان تشرع بالنمو.

2-  درجة الحرارة ويفترض عند دراسة منحنى النمو ان يكون المزروع محضونا بالدرجة الحرارية المثلى لنمو الخلايا، ولكن مع هذا فان درجات الحرارة المثلى ان كانت واطئة نوعا ما فإنها تؤدي الى انخفاض الفعاليات الأنزيمية لذلك يلاحظ طول الطور بانخفاض الحرارة ، ويقصر عندما تكون درجة الحرارة عالية وقد تصل اقصر مدة على استعمال درجات حرارة 37 – 40 م أو أكثر ، ويزداد معدل النمو ولكن على محور نمو خلية وزيادة حجمها ووزنها امام معدل النمو بالنسبة لمؤشر العدد فيقرب من الصفر.

3- طبيعة الخلايا تؤثر أيضاً في طول طور التأقلم، فالخلايا بطيئة النمو بحالتها الطبيعية يكون طور تأقلمها طويلا في حين ان الاحياء سريعة النمو وذات معدلات نمو عالية يقصر فيها الطور.

4- الضغط التنافذي يجب ان يكون عند الحدود التي تتحملها الخلايا وبذلك تتوجه الخلايا الى البناء والنمو بدلا من التوجه لعلاج هذا الاجهاد وهذا ينطبق على كافة المواد التي قد تؤدي الى رفع الضغط التنافذي.

5- الرقم الهيدروجيني يجب ان يكون ملائما لطبيعة الخلايا، فإذا كان منحرفا عن الحد الأمثل فأن الخلايا لا تستطيع النمو وتحلل، وان كان بعضها يسلك مسلكا آخر وهو معالجة الوضع وتوجيه الفعاليات الحيوية البنائية لحماية الخلايا أولاً ثم النمو في مثل هذه البيئات وهذا بدوره يؤدي الى اطالة وقت التأقلم.

6- هناك ظروف اخرى يمكن ان تؤدي الى طول الطور وبعض الأحيان عدم النمو مثل انتقال المواد المؤذية مع اللقاح. وكذلك طبيعة الوسط الغذائي الجديد المستعمل، فالأوساط الغنية تؤدي عادة الى سرعة النمو ولكن غنى هذه الاوساط يجب ان يكون بالوحدات الأساسية مثل الحوامض الامينية والكربوهيدرات سهلة الاستهلاك من قبل الخلايا، اما اذا كانت المواد المستعملة مكوثرة ومعقدة فإن الخلايا تحتاج الى وقت لانتاج الانزيمات الخارجية لغرض تفكيك المواد المعقدة الى مواد بسيطة يمكن قبطها من قبل الخلية. ولذلك يلاحظ ان نمو الخلايا في هذا الطور يكون نموا غير متوازن بالنسبة لمؤشرات النمو المذكورة أعلاه.

وعندما تجمع الخلايا كل المقومات اللازمة للانقسام تستأنف نموها على مستوى العدد وتبدأ بالانقسام بسرعة وذلك يحدث ضمن طور التعجيل B الذي يحصل فيه زيادة معدل النمو، وعادة تبدأ الخلايا بالنمو في هذا الطور بشكل متزامن. ويلاحظ ان النمو في هذا الطور يكون غير متوازنا حيث يطغى المؤشر العددي على المؤشرات الاخرى خاصة الحجم وتكون الخلايا صغيرة الحجم ويمثل أصغر حجم تصله وهي في حالة الفعالية.

الطور اللوغاريتمي

ويمثل هذا الطور نموا متوازنا على مستوى مؤشرات النمو الثلاثة الحجم والوزن والعدد إذ تكون الخلايا بالحجم الطبيعي ولذلك يفضل قياس ابعادها واشكالها وتفاعلها مع صبغة  كرام في هذا الطور كما يمكن قياس وقت الجيل لها.

قياس وقت الجيل :

يمثل وقت الجيل الذي يرمز له gt او td الوقت اللازم لتضاعف المجموع البكتيري او الكتلة الحيوية، ويعتمد على معدل النمو الذي يكون معادلة من الدرجة الأولى عند عدم محدودية المواد الغذائية وكون المؤشرات البيئية الاخرى عند حدودها المثلى. وتقاس الأعداد باللوغارتيمات العشرية لسهولة التعامل او بالغرامات عند قياس الكتلة الحيوية.

ويمكن حساب وقت الجيل وكذلك ثابت معدل النمو K من معرفة أعداد الخلايا في بداية الطور اللوغاريتمي ونهايته (اي تؤخذ نقطتين يكون الخط مستقيما بينها قدر الإمكان)، مع اعتماد قيمة 0.301 قيمة لـ 2log وذلك لان الخلايا الأحادية عادة تنشطر لتعطي خليتين التي تنشطر بدورها لتعطي 4 خلايا وهكذا، وتستعمل الحسابات اللوغاريتمية للحصول على معادلة من الدرجة الأولى اي خط مستقيم او استعمال Semilog paper.

Nt = N₀ + 2ⁿ

N_t  هي النقطة النهائية من الطور اللوغاريتمي التي اختيرت لإجراء الحسابات

  N₀ النقطة الأولية من الطور اللوغاريتمي التي اختيرت لأجراء الحسابات.

N عدد الاجيال المتكونة في المدة الواقعة بين N₀ و N_t

log N_t = log N₀ + n log 2

log N_t = log N₀ + 0.301 n

n = (log N_t – log N₀) / 0.301

ومنها يمكن حساب وقت الجيل :

g_t (td) = t / n

حيث تمثل t الوقت المستغرق لعدد الخلايا N₀ ليصل الى العدد N_t.

ويمكن حساب (K) معدل النمو الذي يمثل عدد مرات التضاعف للساعة الواحدة:

K = log ₁₀ (N^t / N₀) / 0.301 t

ويلي الطور اللوغاريتمي طور التباطؤ وذلك يحدث نتيجة لزيادة عدد الخلايا في الوحدة الحجمية والتي تكون لها سعة معينة تعتمد على حجم الخلايا بشكل أساس وعند زيادة الأعداد تبدأ ظاهرة تحسس الزحام Quorum sensing وفي البكتريا عموما يكون العدد 10⁷  / مللتر كافيا لحث الظاهرة في الخلايا التي تؤدي الى تغير شبه كامل في العمليات الايضية، اضافة الى ان المواد الغذائية تستنفد من البيئة المغلقة المحيطة بالخلايا، وكذلك زيادة الفضلات التي قد تكون سامة للخلايا خاصة عند استعمال اوساط غنية :

• فاذا كانت الاوساط غنية بالكربوهيدرات أدى ذلك الى زيادة الحوامض العضوية حول الخلايا وانخفاض الارقام الهيدروجينية.

• أما اذا كانت الأوساط الغذائية غنية بالمواد البروتينية فان ذلك يؤدي الى رفع الارقام الهيدروجينية.

وفي كلا الحالتين تنحرف الارقام الهيدروجينية عن الحد الأمثل لنمو الخلايا.

كما ان الاوكسجين يقل ذوبانه في مثل هذه الاوساط الغنية بالفضلات والخلايا المزدحمة مما يؤدي الى تأثر الاحياء الهوائية. اضافة الى تغير جهود الاكسدة والاختزال وتغير ظروف اخرى كلها تؤدي الى تباطؤ نمو الخلايا ويصبح النمو غير متوازنا مرة اخرى، ويصبح معدل النمو واطئا.

وتعاني الخلايا في هذه المرحلة من تغيرات كبيرة في أنظمتها وتراكيبها، والاحياء المكونة للأبواغ تبدأ بعملية التبوغ Sporulation .

ويمكن معالجة بعض العوامل في هذه المرحلة مثل التغلب على نقص الأغذية يتم باستعمال المزارع المفتوحة او المستمرة باستعمال جهاز الناظم الكيماوي Chemostat، وادخال الهواء من خلال وسائل معينة، وسحب جزء من وسط النمو للتخلص من الفضلات. ولكن عندما يصل عدد الخلايا الى 10⁹ / مللتر يصبح تزويد الاوكسجين غير مجديا ولا يلائم الخلايا لذا يتضاءل النمو بشكل كبير.

طور الاستقرار Stationary phase

في هذا الطور يصل معد النمو الى الصفر (عند اعتماد المؤشر العددي) وتستمر بعض الخلايا بالنمور على حساب موت وتفكك الخلايا الاخرى، لذا يكون النمو غير متوازنا ولكن يحافظ بالمجمل على حالة الاستقرار العددي.

طور الموت او الانحدار Decline phase

بعد ان تبقى المزارع في طور الاستقرار لمدة والتي تعتمد على الكثير من الظروف ويبدأ عدد الخلايا الحية بالتناقص، ويزداد عدد الخلايا الميتة، ولكن يبقى عددا من الخلايا التي تدعى بالخلايا المثابرة Presistors حيا مقاوما لعدة شهور او سنين للحفاظ على النوع.

كما ان انحدار الطور يعتمد على طرق قياس النمو فالطرق المعتمدة على العد العيوشي تظهر انحدارا شديدا في الميل في الاحياء غير المكونة للأبواغ. اما اعتماد طريقة العد الكلي وقياس الكتلة الحيوية وكذلك قياس الكثافة الضوئية Optical density فهي تظهر ميلا ضحلا للطور. وكذلك يعتمد على درجة الحرارة، فالقياسات التي تتم للإحياء المحبة للحرارة مثلا تظهر ميلا شديدا، اضافة الى تأثير ظروف اخرى.

52

واعتمادا على الاطوار التي ذكرت يلاحظ ان الطور التطبع والطور اللوغاريتمي ترتبط بعمليات النمو والبناء لذلك تسمى الاطوار المرتبطة بالنمو ويطلق عليها أيضاً Trophophase، وفي حالة استعمال الاحياء في هذه الاطوار تكون المواد الناتجة هي مواد ايض اولية Primary metabolites ومنها انتاج الحوامض الأمينية والحوامض العضوية والفيتامينات والكتلة الحيوية. اما في طور الاستقرار وبعد تغير الفعاليات الايضية فيطلق على الجزء الثاني من منحنى النمو وخاصة طور الاستقرار بشكل أساسي وطور الموت بالأطوار غير المرتبطة بالنمو وتسمى Idiophase والمواد التي تنتج منها هي مواد الايض الثانوي Secondary metabolites او Idiolites ومنها انتاج المضادات الحيوية والسموم والصبغات وغيرها من المواد.

ويرتبط انتاج مواد الايض الثانوي عادة بانخفاض معدلات النمو، ولذلك يمكن تغيير معدلات النمو ليس بالتتابع الزمني ودخول الاحياء طور الاستقرار بشكل طبيعي وانما يمكن ان تحول المزارع بعد بناء كتلة حيوية مناسبة وذلك اما بخفض الحرارة او اضافة مواد اساس بطيئة الاستهلاك من قبل الاحياء او اي وسيلة يمكن ان تبطئ من معدلات النمو، وعندها تصبح الخلايا بمثابة مصانع للمواد المراد انتاجها.

والنمو في الاوساط السائلة يختلف تماماً عن النمو على الاوساط الصلبة اذ انه على الاوساط الاخيرة لا يمكن ملاحظة الاطوار المذكورة وانما يمكن ان تظهر الاحياء انماطا من النمو وظواهر خاصة بالنمو على الاوساط الصلبة مثل تكوين الأغشية الحيوية او غير من الظواهر التي سيتم تناولها فيما بعد.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .

مواضيع ذات صلة

نمــو وتكاثر الاحيـاء حقيقية النـواة

تنظيم الفعاليات الحيــــــــوية

انتاج الطاقــــــة

العاثيات البكتيرية Bacteriophages

التغذية

التضاعف والتكاثر في الفيروسات