الغرض من الاختبار Purpose

يستعمل اختبار المالونيت Malonate للتمييز بين Escherichia التي لا تنمو على الوسط و Enterobacter ، ويستعمل كوسط تفريقي بعد توسيعه ليشمل انواع اخرى من العائلة المعوية Enterobacteriaceae.

مبدأ الاختبار Principle

يكون المالونيت واحد من التفاعلات الإنزيمية العديدة لدورة كريبس، اذ يتكون من اكسدة السكسونت succinate الى الفيومريت fumarate ، الذي يتطلب انزيم Succinate dehydrogenase ويختزل مساعد الانزيم FAD الى FADH2 الشكل (1 معادلة 1).

يضاف المالونيت Malonate malonic acid الى الوسط الزرعي الذي يشبه السكسونت ويحل محله كمادة اساسية في التفاعل الشكل ( 1 معادلة 2 ). ان التثبيط التنافسي لانزيم succinate dehydrogenase وتراكم succinate في الخلايا يؤدي الى توقف دورة كريبس وبالتالي يقتل البكتيريا مالم تستطيع تخمر او استهلاك المالونيت كمصدر اخر وحيد للكاربون . ويعد وسط المالونيت السائل محدد لتلك العمليات ، ويحتوي الوسط على تركيز عالي من مالونات الصوديوم sodium malonate ، خلاصة الخميرة وكمية قليلة جدا من الكلوكوز لتعزيز نمو البكتيريا التي تكون بطيئة النمو بدونه. اضافة دوارئ لمعادلة الوسط الزرعي عند اس هيدروجيني 6,7 . صبغة البروم ثيمول الأزرق Bromthymol blue والتي تعطي اللون الاخضر في الانابيب غير الملقحة وتعد دليلا على تغير الـ PH, اذ ان البكتيريا التي لا تستطيع استهلاك المالونيت وتخمر كمية قليلة الكلوكوز سوف تحول الوسط الى اللون الاصفر الخفيف او لا تغير في اللون وهي بذلك تكون نتيجة سالبة. اما اذا استهلكت البكتيريا المالونيت سوف يكون الوسط قاعديا ويتغير لونه من الاخضر الى الازرق الغامق ، وبذلك تكون النتيجة موجبة.

الشكل (1) التثبيط التنافسي للانزيم Succinate dehydrogenase بوساطة malonate
ترتبط جزيئة malonate بالانزيم مما يعمل على منع ارتباط succinate وتحويله الى fumarate

 الوسط الزرعي Media

اذابة ( 1 غم ) خلاصة الخميرة extract Yeast , (2غم) كبريتات الامونيوم Ammonium sulfate,( 0,6 غم) فوسفات البوتاسيوم الثنائية Dipotassium phosphate , ( 0.4غم ) فوسفات البوتاسيوم الاحادية Monopotassium phosphate ،( 2غم ) كلوريد الصوديوم Sodium chloride, ( 3 غم ) مالونيت الصوديوم Sodium malonate, ( 0.25غم)  كلوكوز Glucose ، (0.025غم)  بروم تيمول الازرق Bromthymol blue ، في كمية من الماء المقطر ويعدل الاس الهيدروجيني الى (6,5-6,9) ثم يكمل الحجم الى 1000مل ، ويعقم بجهاز المؤصدة بدرجة 121م وبضغط 15 باوند /انج² لمدة 15 دقيقة يوزع في انابيب ويحفظ في درجة 25م، (ملاحظة يفضل توزيع الوسط في انابيب ثم تعقم ).

طريقة العمل .Method

1- تلقح انابيب الوسط بالبكتيريا المراد اختبارها وعدم تلقيح انبوب السيطرة.

 2- تحضن الانابيب لمدة ( 24 - 48 ) ساعة بدرجة حرارة (35)م ± (2) م .

3- ملاحظة تغير اللون في الانابيب.

النتائج المتوقعة Expected Results

*النتيجة الموجبة : تغير لون الوسط من الاخضر الى الازرق الغامق . شكل (2)

* النتيجة السالبة : تغير لون الوسط الى الاصفر الخفيف او عدم تغير اللون.

            شكل (2) اختبار Malonate الانبوب في الجانب الايسر موجب النتيجة , والانبوب في الوسط سيطرة , اما الانبوب في الجانب الأيمن سالب النتيجة .