مكونات بيئات النمو المستعملة في زراعة الأنسجة (المكونات العضوية)

المركبات العضوية هي تلك المحتوية على كربون كالكربوهيدرات، البروتين، الفيتامينات والهرمونات. وهذه المركبات لا تضاف إلى النباتات النامية في الحقل حيث لها القدرة على تخليقها في عملية البناء الضوئي أو من نواتجها خلال عمليات الأيض المختلفة. لكن الأنسجة المنزرعة معمليا والنباتات الناتجة منها إما أنها تكون صغيرة جداً أو غير قادرة على تكوين مستلزماتها من المواد العضوية لعدم توفر الظروف البيئة الضرورية لذلك. وعلى هذا لوحظ تحسن واضح في النمو والتكشف في مزارع الأنسجة بإضافة هذه المواد إلى بيئة النمو. وتشمل المواد العضوية المضافة لمزارع الأنسجة كما بينتها العديد من المراجع أهمها (1987) Pierik و Thorpe et al (2008) ما يلي:

أ. الفيتامينات

في البداية كانت بعض المواد غير محددة التركيب كلبن جوز الهند، وعصير الطماطم، ومستخلص الخميرة، والكازين المتحلل تضاف لمزارع الأنسجة كمصدر للمواد العضوية. وبالطبع تعتبر تلك المواد مصدر كافي لحاجة المزرعة من الفيتامينات، لكن بالإقلال من استخدام هذه المواد والاستعاضة عنها بمركبات ذات نقاوة عالية ظهرت أهمية إضافتها لبيئات النمو. ومن الفيتامينات التي تضاف إلى معظم البيئات (thiamin (B1 و (nicotinic acid (niacin و (pyridoxine (B6 وكذلك myo-inostol. ولكي يقال إن أحد الفيتامينات ضرورياً لنمو مزارع الأنسجة لابد من التأكد من ذلك بإجراء العديد من الدراسات. وبينت الدراسات أن بعض الفيتامينات التي استعملت في تركيب البيئات الشائعة يمكن أن تستبعد دون التأثير على النمو. فبالرغم من أن بيئة MS تحتوي على اربعة فيتامينات فإن نمو خلايا كالوسات الدخان لم يتأثر عند استعمال الميوانزيتول والثيامين فقط ولم يكن لحامض النيكوتينك والجليسين والبيرودكس تأثير على النمو والفيتامينات التي تضاف غالباً إلى مزارع الأنسجة هي:

1. الميونسيتول Myo-inositol

يعتبر الميونسيتول أحد مكونات فيتامين ب وهو عبارة عن سكر كحولي تابع لمجموعة مركبات asteroisomers وله نشاط حيوي هام لنمو الخميرة وكذلك الخلايا القديمة في مزارع الأنسجة النباتية. ويعتقد أنه هام في تخليق البكتين والهيميسلوليز وبالتالي تخليق الجدر الخلوية. وربما يلعب دوراً في امتصاص بعض الأيونات، حيث زاد امتصاص الكالس لأيونات الفوسفات بزيادة تركيز الفيتامين إلى 4 جم/لتر. وقد يضاف الميوانسيتول في بعض البيئات كمصدر للكربوهيدرات. وتتباين حاجة مزارع الأنسجة للميونسيتول على أساس قدرتها على تخليقه، فالأعضاء لها قدرة على تخليقه عكس الأنسجة غير المتكشفة التي لها قدرة بسيطة على النمو دون إضافته للبيئة، ويعتقد البعض أن هذا الفيتامين ضروري لنمو بعض النباتات خاصة أحادية الفلقة ويعوض نقصه باستعمال لبن جوز الهند أو مستخلص الخميرة. ويضاف الميونسيتول إلى البيئة بكميات كبيرة نسبيا تصل إلى 100 ملجم/لتر. وقد أشار (2008) .vahdati et al إلى أنه أمكن تحسين النمو وزيادة معدل التجذير حتى 70 % لنباتات الجوز Juglans regia برفع تركيز الميوانسيتول إلى ضعف تركيزه في بيئة DKW مع زيادة تركيز النحاس عشر مرات، لكن ارتبط ذلك بالصنف النباتي.

2. الثيامين (Thiamine (B1

يعتبر الثيامينC₁₂H₁₇ON₄SC  من المجموعات الفعالة لبعض إنزيمات دورة كربس، كما يساهم مباشرة في تكوين بعض الأحماض الأمينية وهو أكثر الفيتامينات استخداما في مزارع الأنسجة. وتزيد الحاجة إلى الثيامين بتقدم المزرعة في العمر أو بإجراء نقل جديد للمزرعة إلى بيئة جديدة حيث يعنى ذلك انخفاض المحتوى الداخلي للنسيج منه. فقد انخفض معدل نمو معلق خلايا الذرة تدريجياً ثم ماتت بعد تجديد الزراعة ثلاث مرات عندما كانت البيئة خالية من الثيامين. وربما يكون للثيامين بعض التأثيرات المشتركة مع السيتوكينينات، فقد وجد أن زيادة تركيز Kinetine تسبب تكوين كمية كافية من الثيامين في كالوس الدخان لكن بانخفاض تركيز منظم النمو تفشل الخلايا في النمو والانقسام. وأوضح (1986) .Barwale et al أن تركيز الثيامين في بينة MS والذي يبلغ 0.3 ميكرومول غير كافي لتكوين الأجنة الجسدية عند زراعة الأجنة الزيجوتية لنبات Glycine max وزاد معدل عدد المُستأصَلات النباتية القادرة على تكوين الأجنة الجسدية من 33 % إلى 58% عند رفع التركيز إلى 5 ميكرومول. وزادت تلك النسبة إلى 76% عند اضافة 4 ميكرومول من حامض النيكوتينك.

3. حامض النيكوتنك Nicotinic acid

يدخل حامض النيكوتنك كعامل مساعد للإنزيمات المسئولة عن التفاعلات الضوئية ويضاف إلى البيئة بتركيز 0.1 - 100 ملجم/لتر. كما قد تحتوي البيئات أيضا على البيرودكسين، حامض الفولك، الكولين.

ب . الأحماض العضوية

قد تضاف بعض الأحماض العضوية مثل الستريك الماليك، السكسنك إلى بينات مزارع الأنسجة وذلك لأدوارها التالية:

* دور مخلبي: توجد بعض الأحماض العضوية الثنائية التكافؤ مثل الستريك والماليك والمالونك في خشب بعض النباتات حيث تتحد مع بعض الأحماض الأمينية والأيونات لتكون معقد يساعدها على الانتقال في النبات. كذلك قد تفرز هذه الأحماض في البيئة وتساعد على تيسر الحديد غير المخلبي فتعالج أعراض نقص الحديد.

* دور مغذى: يزداد أيض الأمونيا بإضافة أحماض دورة كربس للبيئة. وقد أمكن بإضافة malic acid و fumaric acid و sodium pyruvate و Potassium pyruvate إلى بيئة النمو زراعة بعض الخلايا بكثافة منخفضة عن الكثافة اللازمة فمثلا يتطلب زراعة المعلق الخلوي حد أدنى من كثافة الخلايا في البيئة. وقد لا تتحمل الخلايا اضافة التركيزات العالية من الأحماض العضوية التي تسبب زيادة الحموضة فمزارع متك التريتيكال تنمو في بيئة N6 بإضافة 35 ملجم/لتر من بيروفيات الصوديوم وحامض الماليك والفيوماريك، لكن ثبط النمو عند رفع التركيز إلى 100 ملجم/لتر. ويمكن التغلب على ذلك بإضافة الأحماض العضوية في صورة أملاح الصوديوم أو البوتاسيوم حيث تعادل الكاتيونات الأنيونات وبذلك يمكن أضافة كمية كبيرة من الأحماض العضوية دون ظهور أعراض التسمم. ويتراوح تركيز أملاح الصوديوم والبوتاسيوم لهذه الأحماض في معظم البيئات بين 35 إلى 140 مليجرام /لتر. وقد شجع Ramming (1990) نمو مزارع أجنة الخوخ بإضافة 5 مليمول من سكسينات البوتاسيوم لبيئة النمو.

* تنظيم الرقم الهيدروجيني: على الرغم من اعتبار الأحماض العضوية ثلاثية الكربوكسيل مصدر للنتروجين العضوي فإنها تعمل بتركيزات عالية تصل إلى 100 ملجم/ لتر على ثبات الرقم الهيدروجيني في مزارع البروتوبلاست لكنها لم تكن فعاله بيولوجيا كالمنظمات الأخرى.

ج . الأحماض الأمينية

ربما تضاف الأحماض الأمينية لبيئة النمو لاستيفاء حاجة المزرعة من النتروجين المختزل، لكن نظرا لارتفاع ثمنها فلا تضاف إلى مزارع الإكثار الدقيق إلا إذا كان هناك تحسين ملحوظ في معدل النمو والتضاعف وغالباً لا تضاف تلك الأحماض لمعظم مزارع الأنسجة على أساس أن البيئة تحتوي على التركيز الأمثل من النتروجين بصورتيه. وبينت التجارب الأولية لزراعة الأنسجة على يد موراشيج وسكوج تحسن نمو مزارع كالوس الدخان بصور واضحة بإضافة لبن جوز الهند والكازين المتحلل، وقد أرجع السبب بصورة جزئية إلى الأحماض الأمينية. كذلك أوضحت بعض الأبحاث التأثير الإيجابي للارجنين بتركيز 0.278 مليمول على نمو معلق خلايا قصب السكر. ويتضح من الدراسات التي استخدمت الأحماض الأمينية أن تأثيرها كان فعالاً على النمو والتكشف في البيئات ذات المحتوى المنخفض من الأمونيا. وأشار (1990) Grimes & Hodges إلى أن تأثير الأحماض الأمينية يتوقف على النسبة بين تركيز النترات والأمونيا في حالة احتواء البيئة على الصورتين. ويجب الإشارة إلى أن الصورة اليسارية فقط L-isomers أو amino - α من الأحماض الأمينية هي الفعالة حيوياً.

يمكن للأحماض الأمينية أن تمد الخلايا بصورة ميسرة سهلة الامتصاص من النتروجين بالمقارنة مع النتروجين غير العضوي (1981 Thom et)، وقد تمتص لتعويض النقص في الفوسفور. لكن ربما يتبادر إلى الذهن السؤال التالي: إذا كان النتروجين المعدني المضاف إلى البيئة يتم تحويله في النبات إلى أحماض امينية ليدخل في تخليق البروتين فلماذا لا يضاف النتروجين في هذه الصورة مباشرة، وبذلك يمكن توفير الطاقة التي تستهلكها الخلية في تخليق الأحماض الأمينية من الأمونيا؟. وبالفعل استطاع (1978) Muller & Grafe زراعة كالوس الدخان في بيئة MS الخالية من النتروجين عند زيادة تركيز البوتاسيوم إلى 6.20 مليمول واضافة أحماض الجليسين والأرجنين والأسبارتك بتركيز 0.1 و 1 و 2 مليمول على التوالي.

لكن يسبب امتصاص الأحماض الأمينية زيادة حموضة البيئة وضرورة وجود محلول منظم للرقم الهيدروجيني أو إعادة ضبطه باستمرار. والسبب الأخر هو اختلاف استجابة النباتات للأحماض الأمينية. وعلى العكس من باقي الأحماض الأمينية يعتبر الجليسين من المركبات المستعملة لتحضير معظم مزارع الأنسجة حيث يضاف بتركيزات متباينة لتدعيم نمو الأشطاء ويصنف أحياناً ضمن الفيتامينات. وبالرغم من الاستعمال الواسع للجليسين كأحد مكونات البيئة يصعب وجود تأكيد قوى لدوره في البيئة، لكنه قد يحمى الأغشية الخلوية من الإجهاد الأسموزي والحرارة (1985 ,Malepszy & Orczyk) وبالرغم أن الأحماض الأمينية ليست ضرورية للنمو فإن الميثونين حالة مختلفة حيث لاحظ (1988) Druar أن اضافة 50-100 ملجم/ لتر من المثيونين يزيد من فاعلية السيتوكينين وبالتالي زاد معدل تضاعف لأشطاء Prunus glandulosa وقد فسر ذلك بدور الميثونين كبادئ في تخليق الإثيلين. ويشيرBister- Miel et al (1985)  إلى دور الجلوتامين الإيجابي في نمو الخلايا بزارعة المعلق الخلوي الذي يعاني من نقص الفوسفات وذلك عندما أضيف الكازين المتحلل للبيئة.

د. السكريات كمصدر للطاقة

الكربوهيدرات مكون هام جداً في بيئة زراعة الأنسجة كعامل ضروري للنمو، وذلك لأن ناتج عملية البناء الضوئي - إن تمت - يكون غير كافي للنمو فالظروف البيئة غير مواتية لإتمام هذه العملية. لكن في بعض المزارع اصبحت بعض السلالات الخلوية cell lines ذاتية التغذية أي يمكنها تثبيت ثاني أكسيد الكربون كمصدر للطاقة، وينخفض معدل نمو هذه الخلايا بانخفاض ثاني أكسيد الكربون في الوسط المحيط الغازي. ونظرا لأهمية ذلك من الناحية الاقتصادية والعملية تعددت الدراسات بهدف دفع الخلايا والنباتات في مزارع الأنسجة لتصبح ذاتية التغذية. وذلك باستخدام تركيزات مرتفعة من ثاني أكسيد الكربون وكثافة ضوئية عالية مع خفض تركيز أو حذف السكر بالكامل من البيئة (1991 Kozai). لكن يجب ملاحظة أن السكر يعمل على تثبيط تكوين الكلوروفيل وعملية البناء الضوئي جاعلاً نمو الخلايا الذاتية التغذية غير ملحوظ، وسيتم الحديث بالتفصيل عن المزارع ذاتية أو خليطة التغذية الضوئية لاحقا.

وقد أشار (1996) Koch إلى دور الكربوهيدرات في تنظيم التعبير الجيني بتنشيط أو تثبيط بعض الجينات. وعلى هذا فمن الضروري إضافة مصدر كربوني للبيئة، وغالباً يستخدم السكر أو بعض البدائل الأخرى كمصدر للطاقة. ويمتص السكر في مزارع أنسجة الجزر بطريقة الانتقال السلبي وقد يمتص جزء منه بالانتقال النشط. ولما كان السكر هو المركب الكربوهيدراتي السائد في عصارة لحاء معظم النباتات فإن معظم البيئات تحتوي عليه كمصدر للطاقة. لكن من الثابت عملياً أن انزيم الانفرتيز المتحرر من بعض الأنسجة المنزرعة معمليا يعمل على تحلل السكر إلى جلوكوز وفركتوز أي أن البيئة تصبح محتوية على الثلاثة أنواع من السكريات (De Klerk & Calamar, 2002). وفى بعض الأشجار خاصة تلك التابعة للعائلة الوردية يعتبر

السوربيتول هو السكر السائد في اللحاء وعلى هذا يكثر استعمال تلك الأنواع من الكربوهيدرات في مزارع الأنسجة.

وعموما يعتبر السكر أنسب مصدر للطاقة يليه الجلوكوز الذي يعطى تأثير مشابه للسكر لكن نظرا لارتفاع سعره فلا يستعمل إلا في الحالات التي قد يفوق تأثيره فعل السكر كحالات تكشف النباتات، لكن يتوقف ذلك على نوع النبات والمستأصل المنزرع. فقد وجد (1985) Phillips & Hubstenberger أن التكشف المباشر للأشطاء من الأقراص الورقية لنبات Capsicum annuum يتطلب وجود الجلوكوز. ويلي الجلوكوز كمصدر للكربوهيدرات المالتوز ثم الرافينوز، أما الفركتوز فأقل تأثيرا من المجموعة السابقة، ويعتبر المانوز واللاكتوز غير مناسبين لزراعة الأنسجة. واستعمل (2009) .Luo et al الجلوكوز والسكروز والمالتوز والفركتوز بتركيز يتراوح بين 5 و 40 جم / لتر في بيئة MS بغرض تكشف الأشطاء من كالس نباتات Dendrobium huoshanense.

ووجد أن الفركتوز غير مناسب على الاطلاق لتكوين الأشطاء بينما زاد عدد الأشطاء باستعمال المالتوز خاصة عند تركيز 10 جم/ لتر ثم السكروز وكان عدد الأشطاء المتكشفة عند استعمال الجلوكوز منخفض جداً. وقد يرجع تفوق المالتوز على السكروز في هذه الحالة إلى بطء تحلل وامتصاص المالتوز ويفترض . Jheng et al (2006) أن النقص في السكر المتاح هو المحفز لعملية التكشف في حين يعتقد (2005) .Krogstrup et al أن الدور المحفز للمالتوز ربما يرجع إلى تأثيره على الضغط الأسموزي للبيئة. كذلك درس (2006) .Shatnais et al تأثير مصادر مختلفة للكربون على تكشف ونمو أشطاء نباتات Pyrus sayriaca باستعمال بيئة MS، ويبين جدول (1) أن السكروز شجع تكوين أشطاء عرضية يصل عددها إلى 6.8 أما الجلوكوز والفركتوز فقد شجعا نمو البرعم الإبطية فقط.

ويكثر استعمال المالتوز في مزارع المتك خاصة للنباتات النجيلية فقد استعمل لتسريع انقسام الخلايا وإنتاج الكالس من زراعة الخلايا الأمية للأرز، كما زاد عدد النباتات الخضراء لنباتات الشعير عندما استعمل المالتوز في مزارع الخلايا الامية. وقد فاق تأثير المالتوز السكر في إنتاج الأجنة الجسدية للعديد من الأنواع النباتية من مثل الكرز البرى والصنوبر وغيرهما (1999 ,.Reidiboym-Talleux et al). ورغم الاستعمال الشائع للسكروز في بيئات الإكثار فإن النتائج السابقة وتلك التي وجدها البعض مثل (2005) .Krogstrup et al و (2006) Gemas & Bessa وتشير إلى مدى أهمية دراسة مدى ملاءمة المالتوز لنمو مزارع الأنسجة. أما الجلاكتوز فقد يكون ساماً لبعض المزارع لكنه بتركيز منخفض قد يقلل من ظاهرة التميز الزجاجي. وأظهرت بعض الدراسات دوره الايجابي، حيث يشجع إنضاج الأجنة الجسدية (1993 ,Schuller & Reuther) وتكوين الجذور على نباتات Annona squamosa في دراسة (1996) Lemon & Blake ربما تستخدم بعض أنواع شراب الذرة المحتوى على جلوكوز ومالتوز والسكريات العديدة كمصدر للكربون حيث أدت إضافته تكشف أعضاء لم تتحقق باستعمال السكر. كذلك ساعد في تكوين أجنة جسدية من طرز خلايا غير جنينيه لكالوس نباتات الجزر عمرها 5 - 10 سنوات. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن أن تتحلل بعض السكريات الأحادية كالأرامنوز، الزيلوز، والثنائية كالمالتوز إلى جلوكوز وفركتوز عند اضافتهم للبيئة وليس من الطبيعي دخول السكريات الكحولية في عمليات الأيض داخل النبات. لكن قد يستعمل المانيتول وهو سكر خامل والسوربتول لزيادة الضغط الأسموزي للبيئة وفى هذه الحالة لابد من إضافة كمية من السكر لتوفير الطاقة، ومن الجدير بالذكر أن إضافة المانيتول والسوربتول يجعلان البورون غير ميسر.

جدول 1: تاثير مصادر مختلفة من الكربوهيدرات على نمو نبات Pyrus sayriaca في بيئة MS تحتوي على 1 ملجم / لتر BA و 0.1 ملجم / لتر IBA Shatnawi et al 2006)).

التحلل المائي للسكر

مما لاشك فيه أن تركيز السكر من العوامل المؤثرة على النمو والتكشف في مزارع الأنسجة. وقبل أن نستعرض ذلك لابد أن نشير إلى أن جزء من أو كل السكر المضاف للبيئة يتحلل مائيا إلى مكوناته من السكريات الاحادية من الجلوكوز والفرتكوز ويحدث هذا أيضاً للسكر بعد امتصاصه كي يدخل في عمليات الأيض. ولاحظ (1985) Kromer & Kukulczanka زيادة معدل بقاء القمم الميرستيمية لنباتات Camma indica بإضافة 25 5 جم/لتر من الجلوكوز والفركتوز على التوالي بدلاً من 30 جم/لتر سكر. لكن لم يكن لتلك السكريات الأحادية نفس الدور المحفز للسكر لتطوير الأجنة الجسدية لنباتات Pseudotsuga menziesii طبقا لملاحظاتTaberer et al (1998) . وقد سجل (1997) .De Reik et al تحلل السكروز في البيئة المستعملة لزراعة Rosa multiflora في مرحلتي التضاعف وتكوين الجذور.

وتؤدى عملية التعقيم بالاوتوكلاف إلى التحلل المائي لبعض السكر ويزيد هذا التحلل إذا اضيف السكر إلى باقي محتويات البيئة مقارنة بتعقيم السكر بمفرده. ويؤثر الرقم الهيدروجيني للبيئة على مدى تحلل السكر، حيث يزيد ذلك بانخفاض الرقم الهيدروجيني وقد قدر أن 10-15% من السكر يتم تحلله مائيا إلى جلوكوز وفركتوز عندما يكون الرقم الهيدروجيني 5.5 : 5.8. وقد وجد أن الخلايا تنمو بدرجة أحسن في بيئة معقمة بالأوتوكلاف بالمقارنة مع تلك المعقمة بالمرشحات وأرجع ذلك للتحلل المائي للسكر (2008 ,.Thorpe et al).

لكن من الصعب الإجابة على سؤال هل التعقيم بالأوتوكلاف مرغوب ام لا لبيئة مزارع الأنسجة؟ لتعارض الكثير من الأبحاث حول ذلك، ويبدو أن للطرز الوراثية دوراً في تلك الاستجابة. وبالإضافة إلى التحلل المائي للسكر يتم أيضاً تكسيره إلى سكريات أحادية كالجلوكوز والفركتوز أثناء الزراعة ببعض الإنزيمات مثل الانفرتيز الموجود في الجدر الخلوية أو بالإنزيمات المتحررة من الخلايا ويتوقف ذلك على النوع النباتي. وقد وجد (1985 ,Zamski & Wyse) أن كل السكر المضاف إلى بيئة قصب السكر يتحلل مانيا خلال ثلاثة أيام. كما أن لدرجة حرارة المزرعة تأثير على تحلل السكر المضاف فقد تأثر نمو جذور الطماطم المنزرعة في البيئة بتركيز السكر، لكن ارتبطت الاستجابة بدرجة حرارة البيئة. حيث أدى تغير درجة الحرارة عن 28 م إلى التأثير على نشاط إنزيم الإنفرتيز الذي أثر بدوره على معدل النمو. لكن أدى انخفاض درجة الحرارة إلى انخفاض معدل النمو على الرغم من أن نشاط الإنزيم ظل عالياً.

تأثير السكر على مزارع الأنسجة

اهتمت العديد من الأبحاث بتقدير التركيز المناسب للسكر في مزارع الأنسجة خاصة فيما يتعلق بنمو الأفرع والأجنة الجسدية، ولم يكن هناك اهتمام كبير بدراسة تأثيره على الأنسجة غير المتكشفة. وبالطبع فإن التركيز الأمثل لنمو الكالس ليس هو نفسه المناسب لنمو الأفرع المتكشفة. ويتوقف هذا التركيز على عوامل منها النوع النباتي، الجزء المنزرع عمر المزرعة باقي مكونات البيئة، فقد يسبب التركيز المرتفع نسبياً بنسبة تصل إلى 4.5% ظهور أعراض التميز الزجاجي في بعض النباتات كالقرنفل بينما يشجع النمو والتكشف في نباتات أخرى (1991 ,Ziv). وقد لا تزيد استفادة المزرعة من زيادة تركيز المكونات الغذائية للبيئة إلا إذا زاد تركيز السكر، فمثلاً لا يتضح تأثير التركيز المرتفع من النتروجين في عملية التكشف إن لم تحتوي البيئة على تركيز مناسب من السكر. وقد تأثر امتصاص مزارع نبات Dendrobium للنترات والأمونيا من البيئة بتركيز ونوع السكر المضاف. وقد لا يكون التركيز المناسب لإبقاء الأجزاء المنزرعة حية وتكوين الأشطاء مناسباً لتكوين الجذور على النباتات المتكشفة، ففي تجربة لإكثار نباتات Lilium longiflorum باستعمال أجزاء من الساق كان تركيز 3-4% من السكر فعال جداً في تكشف البراعم لكن لم تتكون جذور على النباتات المتكشفة حتى بعد 90 يوما من الزراعة. لكن بخفض التركيز إلى 2% كان عدد الأشطاء المتكون أقل قليلا كما يبين جدول رقم ( 2) لكن تم استحثاث عملية التجذير بعد 60 يوم من الزراعة. ويتضح من الجدول مدى تأثير السكر على نجاح مرحلة تأسيس المزرعة.

وفي دراسة على نمو البراعم العرضية وتجذير أفرع Ficus carricad يبين الشكل التالي تأثر النمو الخضري وطول وعدد الجذور بعد ثلاثة أشهر من زراعة العقل الساقية في بيئة MS تحتوي على صفر و 15 و 30 جم/لتر. وفي دراسة قام بها (2002) Carelli & cheverrigaray لإكثار صنف الورد Baronesses بالبراعم الجانبية استعمل المانيتول والسربيتول والجلاكتوز والجلوكوز كمصدر للسكر.

ووجد أن الجلوكوز والسكر هما الأفضل من حيث عدد الأشطاء المتكشفة وطول الأشطاء. وعلى الرغم من عدم وجود اختلافات بين تأثير التركيزات المختلفة من السكر فإن أفضلها كان 3% لتلافى ظاهرة التميز الزجاجي. وقد أشار Langford (1987) & Wainwright إلى أن خفض تركيز السكر في بيئة النمو يزيد من معدل التضاعف للورد. أما من ناحية تأثير تركيز السكر على تكوين الأجنة الجسدية فقد أدت زيادة التركيز من 3 إلى 6% إلى زيادة معنوية في عدد الأجنة المتكونة ليصبح 6 لكل مستأصل نباتي من السويقة الجنينية العليا لنباتات Pelargnonium zonal وبصورة عامة يؤثر السكر على التكشف في:

1. تكوين الحزم الوعائية: تساهم السكريات بوضوح في تكشف عناصر الخشب واللحاء في خلايا مزارع الأنسجة المنزرعة فوجود السكر ضروري لتكوين قصيبات الخشب tracheid واتضح من بعض التجارب أن عدد الأنابيب الغربالية والخشب المتكون ونسبة كل منهما إلى الأخر تتوقف على تركيز السكر. إلا أنه ليس من الواضح تماما ما إذا كانت السكريات تقوم بدور أخر غير كونها مصدر للطاقة اللازمة لعمليات الأيض النباتي الضرورية للتكشف.

جدول 2: تأثير تركيز السكر في الحفاظ على حياة المُستأصلات النباتية المنزرعة وتكشف الجذور على النباتات المتكشفة من نبات Lilium longiflorum. بعد شهرين من الزراعة (2007 ,Azadi & Khosh-Khui).

شكل يبين نمو وتجذير العقل الساقية لنباتات F. carrica في بيئة MS تحتوي على تركيز 30 و 15 و صفر جم/لتر من السكر (من اليمين إلى اليسار على التوالي، وذلك بعد شهرين من الزراعة).

2. تكوين الكلوروفيل: يعتبر تركيز السكر المشجع للنمو في مزارع الأنسجة مثبطاً لتكوين الكلوروفيل لكن هذا التركيز المثبط يختلف باختلاف الأنواع النباتية، فبعض الأنواع لها القدرة على تخليق الكلوروفيل عندما يكون تركيز السكر في البيئة صفر. وقد أرجع ذلك إلى أن السكر يعمل على تثبيط الأنزيم المخلق لـ 5-aminolaevulinic acid (ALA) وهو بادئ لتكوين جزئيات Porphyrin الداخلة في تكوين الكلوروفيل. وبزيادة مدة نمو المزرعة في وجود السكر تفقد الخلايا قدرتها على تكوين الكلوروفيل وتمتلئ البلاستيدات بالنشا ويتغير محتواها من الأحماض النووية RNA و DNA، وقد تكون بعض الأشطاء النامية في مزارع الأنسجة قادرة على القيام ببعض النشاط الضوئي وعملية البناء بشرط أن يكون تركيز السكر منخفض.

3. تراكم النشا والتكشف: يتراكم النشا غالباً في بلاستيدات خلايا الكالس وكذلك في معلق الخلايا خصوصا في مرحلة الثبات من منحنى النمو. ولما كانت عملية التكشف تحتاج إلى طاقة فإن النشا يتم تحلله في مرحلة التكشف، وينخفض تركيزه وتزيد سرعة عملية التنفس في مزارع الأشطاء عن الكالس أي أن السكر من متطلبات عملية التكشف (1986 ,.Thorpe et al) و (2007 ,Azadi & Khosh-Khui. ولوحظ تراكم النشا الذي مصدره السكر في خلايا الدخان في بعض المواقع التي تتكشف فيما بعد إلى أشطاء. وعلى هذا يُقترح أن عملية تراكم النشا من متطلبات حدوث التكشف حيث يعمل كمصدر للطاقة اللازمة لتكشف القمم الميرستيمية والأشطاء. لكن لا يتم تراكم النشا قبل التكشف في بعض الأنواع النباتية (1987 ,Von Arnold)، والاكثر من ذلك قد يؤدى تراكم النشا في بعض النباتات إلى تثبيط التكشف. مثلا لوحظ أن خلايا البرسيم الحجازي المنتخبة لتحمل الملوحة تفقد قدرتها على التكشف بعد زراعتها لمدة ثلاث سنوات في بيئة تحتوى 3% سكر، وبنقل الخلايا إلى بيئة تحتوى على 1% سكر وتركيز عالي من D-2,4 لمدة 24 يوم انخفض تركيز النشا وتكشفت الأشطاء ( Rains et al., 1980).

هـ . المواد العضوية غير محددة التركيب

قبل استخدام الكيماويات عالية النقاوة كانت بيئات مزارع الأنسجة تتضمن بعض المركبات غير محددة التركيب والتي تمتاز باحتوائها على عدداً من المواد المختلفة والتي يختلف تركيزها من مستحضر لآخر. ومن هذه المواد التي أثبتت فاعلية في مزارع الأنسجة لبن جوز الهند، الكازين المتحلل مستخلص الخميرة، عصير البرتقال. وتحتوي هذه المواد على عناصر غذائية هرمونات، فيتامينات، أحماض عضوية وأمينية. فعلى سبيل المثال عند تحلل بروتين الكازين بالأحماض أو بالإنزيمات تتكون العديد من الوحدات الصغيرة عبارة عن خليط من الأحماض الأمينية يصل عددها إلى 18 حامض والسلاسل الببتيدية مختلفة الأطوال والفيتامينات التي يمكن أن تمتص بواسطة الأنسجة النباتية كمصدر للعناصر المعدنية مثل الكالسيوم والفوسفات (2008 ,.Thore et al). وأشار أيضاً إلى اعتبار الكازين المتحلل مصدرا جيدا لحامض الجلوتامين عند نقصه في البيئة بسبب عدم كفاية محتواها من الفوسفات. وقد سجل (1988 ,.Suezawa et al) تحسين في معدل نمو معلق خلايا نباتات Actinida chinensis بإضافة 5 مليمول من الجلوتامين وبالطبع فإن استعمال الكازين المتحلل يكون أفضل من إضافة الأحماض الأمينية الناتجة من تحلله لاحتوائه على العديد من المركبات الأخرى كما سبق الذكر. لكن رغم ذلك يندر استخدام هذه المواد في مزارع الأنسجة الآن لأنها غير نقية تماما ويتغير تركيبها تبعاً للمصدر وطريقة التحلل.