مرحلة اقلمة النباتات النسيجية للظروف الطبيعية Acclimatization to natural environment

يعتبر نجاح عملية نقل النبيتات الناتجة تحت الظروف المعملية إلى الحقل والتي يطلق عليها الأقلمة acclimatization أو adaptation المقياس النهائي لنجاح البرنامج المستعمل لزراعة الأنسجة وقياس جدوى استعماله على النطاق التجاري. حيث تتعرض النباتات إلى صدمة مفاجئة تسبب موت الكثير منها. وتلعب درجات الحرارة، الرطوبة النسبية، شدة الإضاءة، تركيز ثاني أكسيد الكربون وسرعة حركة الهواء في غرفة النمو وبالتالي تأثيرها على المناخ الدقيق دورا كبيرا في نجاح الأقلمة. ويرجع فناء عدد كبير من النبيتات عند نقلها إلى الظروف الطبيعية إلى الاختلاف الشديد بين النبيتات الناتجة من زراعة الأنسجة وتلك النامية في الظروف العادية من حيث التركيب التشريحي والشكل الظاهري وما يترتب على ذلك من خلل في الوظائف المختلفة للأعضاء النباتية. فمن المعروف أن ظروف النمو في مزارع الأنسجة تضمن أقل معدل إجهاد وأفضل ظروف لتكوين ونمو النباتات من حيث ارتفاع الرطوبة النسبية، مع توفير الكربوهيدرات في صورة جاهزة. كذلك تلعب منظمات النمو المضافة للبيئة دورا في التغييرات الظاهرية والوظيفية لهذه النبيتات 1982 ,Wetzstein & Sommer. والتي قد تكون غير ذاتية التغذية تماما heterotrophic أو على الأقل خليطه التغذية الضوئية photomexotrophic ويجب دفعها لتصبح ذاتية التغذية الضوئية photoautotrophic بتحوير وسط النمو.

من الضروري أن تحتوي البيئة على تركيز عالي من السكر والأملاح المعدنية لضمان التكشف والنمو. ومن الثابت الآن أن السكر المضاف للبيئة يؤثر على بعض عمليات الأيض الثانوية وبالتالي محتوى النباتات من المواد العضوية المختلفة. وقد يتبادر للذهن أن تلك الأوراق ربما تكون مكتنزة بالمواد الغذائية المختلفة التي امتصتها سابقاً من البيئة وبذلك تدعم النمو عند الأقلمة. وبالفعل كان معدل النجاح في أقلمة نباتات Potentilla fruticosa و Ficus lyrata أعلى عند استعمال تركيز 2-4% من السكر وكذلك ارتفع الوزن الرطب والجاف للنباتات، وانخفض معدل نجاح الأقلمة ووزن النباتات عند استبعاد السكر من البيئة. وربما يكون للسكر أهمية في زيادة النمو والتجذير أثناء الإكثار الدقيق فقد لاحظ (1993) Dang &Donnelly زيادة في معدل تكوين الجذور وكثافة الشعيرات الجذرية لنباتات Rubus بخفض تركيز السكر وزيادة ثاني أكسيد الكربون، لكن قد تتباين هذه الاستجابة حتى بين أصناف النوع الواحد Smgh & Shyamal (2001) وعموما يمكن القول أن خفض تركيز السكر يشجع من اعتماد النباتات على نفسها في تخليق السكر وبعض منظمات النمو والفيتامينات الضرورية للنمو بعملية البناء الضوئي. وقد يلاحظ ارتباط موجب بين زيادة تركيز السكر والكتلة الحيوية ومعدل تكوين الكلوروفيل للعديد من النباتات المعملية خاصة عند زيادة شدة الإضاءة، مما يعني أن فرضية التأثير السلبي للسكر على تخليق الكلوروفيل ليست مطلقة (1996 ,Koch).

لكن يحدث تثبيط لعملية البناء الضوئي عند زيادة شدة الإضاءة وتكون النباتات حساسة لهذه العملية تحت ظروف الإجهاد المختلفة ومنها نقص معدل عملية البناء الضوئي، كما يسبب انخفاض معدل ثاني أكسيد الكربون في مزارع الأنسجة تثبيط ضوئي لعملية البناء الضوئي. وقد سجل (2000 ,.Serret et al) ذلك في مزارع Gardenia jasminoides باستعمال تركيز من السكر يتراوح بين 0.5 و 3% وكثافة ضوئية 100 - 300 مكرومول / م2 / ث وباستخدام أوعية تسمح بتبادل الغازات انخفض معدل التثبيط، لكن حدث التثبيط أيضاً لنباتات الدخان في أوعية بدون أغطية عند رفع شدة الإضاءة إلى 700 مكرومول /م2 /ث (2002 ,.Semoradova et al). وقد كان لزيادة ثاني أكسيد الكربون باستعمال أغطية تسمح بالتهوية دوراً في التغلب على التثبيط الضوئي قبل وأثناء الأقلمة.

وربما يكون للسكر فائدة في منع التثبيط الضوئي وإصلاح بعض العطب في آلية هذه العملية، وبالتالي تزيد كفاءة البناء الضوئي بإضافة السكر بشرط كفاية محتوى الأوراق من صبغات البناء الضوئي فقد وجد أن نباتات G. jasminoides التي نمت في بيئة تحتوي على 3% سكر وشدة إضاءة مرتفعة أقل تأثراً بالتثبيط الضوئي عند الأقلمة من تلك التي نمت في وسط خالي من السكر وباستعمال شدة إضاءة منخفضة. وقد يرجع ذلك إلى تشجيع السكر للنمو الذي يعمل بدورة على تكوين خلايا جديدة لها قدرة أعلى ويوضح (1998) .Ticha et al أن نمو النباتات في حالة

على البناء الضوئي. photomixotrophic يزيد من معدل النمو وكفاءة البناء الضوئي مقارنة استعمال مع وسط خالي من السكر. وقد لعب إضافة تركيز منخفض من السكر دورا في الحد من التأثير المثبط للكثافة الضوئية على البناء الضوئي، لكن كانت نباتات G. jasminoides اشد حساسية للتثبيط الضوئي عند إضافة السكر للبيئة مما يشير إلى أن الارتباط بين إضافة السكر والتثبيط الضوئي يتوقف على التركيب الوراثي.

وهناك العديد من الأبحاث التي تؤكد زيادة معدل نمو النباتات الخضراء في مزارع الأنسجة برفع تركيز ثاني أكسيد الكربون وشدة الإضاءة. وعموما كان لنظرية التأثير الإيجابي للسكر على نجاح الأقلمة نصيب قليل من النجاح حيث يعتقد Hazarika (2003) أن الضرر الشديد الناتج عن فقد الماء من أنسجة الأوراق يفوق تأثيرها كمواد مخزنة في الأوراق. لكن يصعب زيادة شدة الإضاءة الضرورية للبناء الضوئي لتماثل تلك في البيوت المحمية نظرا لارتباط ذلك بحدوث التثبيط الضوئي لعملية البناء الضوئي. كذلك رفع درجة الحرارة يزيد التكاليف الخاصة بتبريد غرفة النمو. أضف إلى ذلك أن أغلب الأغطية المستعملة لا تسمح بتبادل الغازات بين غرفة النمو وجو المزرعة فينخفض تركيز ثاني أكسيد الكربون وبالتالي تنخفض كفاءة البناء الضوئي للنباتات بدرجة عالية فيلاحظ قصور في تطور العضيات الخاصة بذلك على الرغم من أن الشكل الظاهري للنباتات قد يبدو طبيعياً. وفقدت النباتات ثلاثية الكربون ذاتية التغذية الضوئية ما يقرب من 50% من الكربون الذي تم تثبيته في عمليات البناء الضوئي نظرا لعملية التنفس الضوئي تحت الظروف الطبيعية من تركيز الأكسجين (21%) وتركيز 345 ميكرومول/ مول من ثاني أكسيد الكربون، وبخفض تركيز الأكسجين إلى 1% توقفت عملية التنفس الضوئي (2003 ,Hazarika).

وأشار (1998) Ticha et al إلى تباين محتوى أوراق النباتات المعملية من صبغات البناء الضوئي بالمقارنة مع النباتات في البيت المحمي على أساس تركيز السكر وشدة الإضاءة فقد سجل (2010) Mohamed & Alsadon انخفاض في تركيز كلوروفيل أ و ب وكذلك الكلوروفيل الكلى لنباتات البطاطس النامية في أوعية مغلقة وباستعمال بيئة تحتوى على 3% سكر بالمقارنة من النباتات النامية في أوعية تضمن عملية تبادل الغازات وخفض الرطوبة النسبية وباستعمال تركيز 2% من السكر. وبزراعة نباتات Phalaenopsis في بيئة تحتوى على 3% سكر أو بدون السكر وتحت التركيز الطبيعي من ثاني أكسيد الكربون أو 1000 ميكرومول/ مول سجل .Yoon et al (2009) اختلافات في معدل النمو. وقد زاد محتوى الأوراق من كلورفيل أ و ب وكذلك النسبة بينهما والنسبة بين الكلورفيل والكاروتينات بينما لم يتأثر محتوى الأوراق من الكاروتينات قبل الأقلمة أو بعدها عند إضافة السكر مع رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون. وقد زاد معدل النتح في أوعية الزراعة بزيادة تركيز ثاني أكسيد الكربون سواء بإضافة السكر أو بدون إضافة السكر للبيئة. كذلك زاد محتوى النباتات من السكر والنشا قبل الأقلمة وعقبها بزيادة تركيز ثاني أكسيد الكربون. ويشر ذلك إلى أن النباتات التي نمت في المعمل تحت تركيز عالي من الغاز كانت ذات كفاءة عالية في البناء الضوئي عند أقلمتها.

ولا يتوقف الأمر على صبغات البناء الضوئي إذ يلاحظ أيضاً نقص في معدل إنزيمات البناء الضوئي مثل (ribulose bisphosphate carboxylase (Rubase. فعلى الرغم من نظام النقل الإلكتروني الفعال في النبتات المعملية فإن عملية البناء الضوئي لم تكن فعالة لنقص الكلوروفيل وإنزيم RubPcase ولم تنشط هذه العملية بالأوراق التي تطورت أثناء زراعة الأنسجة حتى بعد نقل النباتات للبيت المحمي. وقد ماتت تلك الأوراق عقب ذلك، لكن قد تمثل هذه الأوراق كما في الفراولة مخزن يمد الأوراق الحديثة بالكربون والنشا (1988 ,Grout). ويعتقد أنه في بعض النباتات مثل Dieffenbachia قد يكون للأوراق التي تطورت في المعمل القدرة على البناء الضوئي عند الأقلمة.

انخفض معدل صافي عملية البناء الضوئي للعديد من النباتات في الأيام الأولى من أقلمة النباتات إلا أن هذا المعدل ارتفاع عقب ذلك وقد ارتبط ذلك بتكوين الأوراق الحديثة في البيت المحمي (2000 ,.Van Huylenbroeck et al). وقد انخفض معدل البناء الضوئي خلال أربعة أسابيع من زراعة أشطاء Birch على الرغم من استعمال شدة إضاءة تتراوح بين 200 و 1200 ميكرومول/ م2/ ثانية، لكن كان للنباتات في البيت المحمي تحت نفس شدة الإضاءة القدرة على البناء الضوئي (1986 ,.Smith et al) لكن في دراسة موسعة لعدة أنواع من نباتات الزينة سجل (1987) .Kozai et al انخفاض حاد في تركيز ثاني أكسيد الكربون داخل أوعية الزراعة تراوح من 3000 - 9000 جزء في المليون أثناء الظلام إلى أقل من 90 جزء في المليون أثناء فترة الإضاءة، مما يشير إلى قدرة النباتات على القيام بالبناء الضوئي. وقد يكون سبب بطء البناء الضوئي عقب ذلك نقص تركيز ثاني أكسيد الكربون ومن ثم سجل صافى معدل عملية البناء الضوئي للعديد من النباتات المعملية مثل Myrtus communis زيادة برفع معدل تبادل الغازات في الأوعية (2001 ,.Lucchesini et al).

وباستعراض العديد من الدراسات حول صافى معدل عملية البناء الضوئي للنباتات المعملية يرى (2007) .Pospišilova et al أن انخفاض معدل صافي عملية البناء الضوئي في مزارع الإكثار الدقيق يرجع إلى نقص تركيز ثاني أكسيد الكربون في الأوعية محكمة الغلق على الأقل في النصف الأخير من فترة الإضاءة. وقد تأثر محتوى الأوعية من الغاز خلال اليوم الواحد على تركيز السكر بالبيئة. ويجب التأكيد على أن زيادة شدة الإضاءة دون رفع معدل ثاني أكسيد الكربون لا تزيد من كفاءة البناء الضوئي عند نقطة التعويض compensation point حيث تتساوى كمية غاز ثاني أكسيد الكربون الناتجة من التنفس مع التي تستهلك في البناء الضوئي.

إنتاج نباتات نسيجية ذاتية التغذية الضوئية Photoautotrophic

قد تنمو النباتات في مزارع الأنسجة بطريقة وسطية بين ذاتية التغذية الضوئية وغير ذاتية التغذية حيث تحصل على ثاني أكسيد الكربون من الوسط الغازي والكربون العضوي المضاف في صورة سكر من البيئة. وقد برزت أهمية تطوير تقنية الإكثار الدقيق لجعل النباتات ذاتية التغذية الضوئية بهدف تقليل تكاليف الإنتاج واستعمال الميكنة في الإكثار الدقيق بواسطة (1998) Kozi & Iwanami حيث تمكن هذه التقنية من استعمال أوعية كبيرة الحجم مع خفض معدل التلوث. ويكون للأوراق التي تكونت في المعمل القدرة على الحياة والقيام بالبناء الضوئي عند الأقلمة.

وتعد تكاليف الإكثار الدقيق من معوقات استخدامه على نطاق واسع خاصة في الدول النامية، ويمثل السكر والآجار المستعمل لتصلب البيئة حوالي 80 % من تكاليف البيئة. وقد أشار (2003) .Prakash et al إلى أن تكاليف لتر واحد من بيئة MS المضاف إليها الآجار يصل إلى 0.18 دولار أمريكي، وتنخفض القيمة إلى 0.08 في حالة استبعاد الأجار. وإذا كانت المزرعة ذاتية التغذية ولا يتطلب الأمر إضافة السكر فإن التكاليف ستنخفض إلى 13. 0 و 0.03 دولار للبيئة الصلبة والسائلة على التوالي. ولاستعمال السكر في البيئة مشكلة أخرى حيث يجعل البيئة وسط ملائم لنمو الكائنات الحية الدقيقة. لكن يتطلب الأمر تشجيع الأنسجة النامية المحتوية على الكلوروبلاست من القيام بعملية البناء الضوئي ظروف خاصة. وأضاف (1991) Kozai أن النباتات النامية تحت تلك الظروف تمتاز بمجموع جذري قوى وقدرة أفضل على الاتزان المائي ومقاومة الفطريات أثناء الأقلمة (1995 ,.Jeong et al).

في نظام المزارع ذاتية التغذية الضوئية والتي يطلق عليها PTCS "Photoautotrophic Tissue Culture System يجب توفير تركيز عالي من ثاني أكسيد الكربون بمعدل 1000 - 1500 ميكرومول / مول من الغلاف الغازي للمزرعة مع شدة إضاءة لا تقل عن 150 ميكرومول /م2/ث وبدون إضافة السكر أو استعماله بتركيز منخفض 1997 ,.Kozai et al). ويمكن زيادة تركيز ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الغازي للمزرعة إما بدفع تيار منه إلى داخل أوعية الزراعة التي يفضل أن تكون كبيرة الحجم أو برفع تركيزه في حجرة الزراعة مع استعمال أغطية تسمح بالتبادل الغازي (1988 ,Kozai &Iwanami) وقد أمكن الحصول على معدل نمو لنباتات القرنفل والأراولا والبرميولا تحت هذه الظروف يعادل النمو باستعمال السكر. وتبين النتائج الموضحة في جدولي رقم (1) و (2) التأثير الإيجابي لزيادة تركيز غاز ثاني أكسيد الكربون على نمو النباتات، ويتضح أن زيادة الغاز قد تعوض نقص النمو النتائج عن عدم إضافة السكر.

جدول 1: نمو نبيتات Chrysanthemum بعد 4 أسابيع من الزراعة في بيئة شبه صلبة محتوية على السكر أو خالية منه تحت تركيز متباين من ثاني أكسيد الكربون (Kozai & Iwanami, 1988).

جدول 2: تأثير تركيز السكر وثاني أكسيد الكربون (حجم/حجم) على نمو نباتات الاراولا بعد 4 أسابيع من الزراعة في بيئة سائلة (1998) .Mitra et al.

وتعمل هذه الظروف على خفض الرطوبة النسبية في جو المزرعة والتي تلعب دورا في ظاهرة التميز الزجاجي وقد أمكن باستخدام هذه الأنواع من الأغطية وبدون زيادة في تركيز ثاني أكسيد الكربون زيادة معدل نمو ومحتوى الكلوروفيل لنباتات البطاطس (2010 ,Mohamed & Alsadon). وفي نباتات الدخان زاد محتوى أوراق النباتات ذاتية التغذية الضوئية من صبغات البناء الضوئي عند أقلمتها لكن حدث انخفاض فجائي في هذه الصبغات للنباتات خليطة التغذية الضوئية في الأسبوع الأول من الأقلمة أعقبه زيادة في الأسبوع التالي (1998 ,.Kadlecek et al). زرع (1998) .Mitra et al عقد ساقية بطول 1 سم من نباتات Chrysanthemum في بيئة MS سائلة أو شبه صلبة مضاف إليها 0.1 ملجم/ لتر IAA و 0.2 ملجم/لتر والسكر بتركيز صفر أو 20 جم/لتر. وتم تدعيم النمو في البيئة السائلة باستعمال ورق الترشيح أو القطن. وتم رفع تركيز غاز ثاني أكسيد الكربون ورطوبة نسبية 62% وشدة إضاءة 74 مليمول/ م2 / ثانية لمدة 16 ساعة يومياً لمدة 30 يوم لرفع كفاءة الأقلمة. ويتضح التأثير الجوهري في ظروف النمو المشجعة لإنتاج نباتات خليطة التغذية الضوئية في:

1. تركيب الثغور

يعتبر الفقد السريع للماء من الثغور والأسطح الخارجية للنبات من أهم مشكلات الأقلمة حتى لو كان الجهد المائي لمحلول التربة المستعملة في الأقلمة أعلى من الجهد الماني للبيئة. ففي العديد من النباتات فقدت الثغور الاستجابة للعوامل البيئية التي من شأنها غلق الثغور، ولعل الخلل الذي يصيب تركيب الثغور من حيث حجم الخلايا الحارسة وطول وقطر فتحة الثغر هو السبب وراء ذلك.

لكن يلعب الطرز الوراثي دوراً هاماً في كثافة الثغور وتركيبها التشريحي في النباتات المعملية فعلى سبيل المثال لم يكن هناك اختلاف في تركيب الثغر وآلية عمله للعديد من الأنواع النباتية منها الطماطم والبطاطس وغيرها، ومن ثم نجد أن معدل أقلمة تلك النباتات قد يصل إلى 100 % حتى بدون التدقيق في علمية الأقلمة Mohamed et al (1999) . باستخدام نباتات Tagetes minuta وبالفحص المجهري يتضح الفرق بين تركيب ثغور النباتات المعملية وتلك النامية في البيوت المحمية أو الحقل. وتأخذ الثغور الشكل الدائري أو الهلالي وليس البيضاوي أو الكلوي كما في النباتات في البيوت المحمية (الشكل التالي) وبالنظر إلى معامل عدد الثغور وهو عبارة عن عدد الثغور منسوباً لعدد خلايا البشرة فقد يسجل ارتفاعاً في بعض الأنواع أو انخفاضا في الأخرى بالمقارنة مع النباتات النامية في البيت المحمي، فقد انخفضت هذه النسبة في أوراق نخيل البلح المعملية بالمقارنة مع النباتات في البيوت المحمية، ولم ترتفع حتى بعد المعاملة بمركب PEG. وقد انخفضت كثافة الثغور عقب نقل النباتات للبيت المحمي. لكن لاحظ (1999 ,.Pospisilova et al) عدم تغيير عدد الثغور بالسطح العلوى والسفلى لأوراق الدخان، لكن نظرا لسرعة نمو الأوراق عقب الأقلمة فقد زاد عدد الثغور للضعف. وتساعد خفض الرطوبة وتركيز السكر في بيئة الزراعة على خفض عدد الثغور والتي أخذت شكلا بيضاوياً كتلك المميزة للنباتات في البيت المحمي على العكس من النباتات التي نمت في أوعية زراعة عادية مع رفع نسبة السكر في البيئة (Mohamed (2010&Alsadon وتشير هذه الدراسة وغيرها إلى انخفاض عدد الثغور للنباتات خليطة التغذية الضوئية أو ذاتية التغذية الضوئية عقب النمو في البيت المحمي.

شكل يبين : شكل الثغور في أوراق نباتات البطاطس (A) خليطة التغذية الضوئية (B) وغير ذاتية التغذية 2010 Mohamed & Alsadon.

2. التركيب التشريحي للأوراق

تكونت طبقة الميزوفيل في أوراق الدخان المعملية من طبقة واحدة مفككة من الخلايا العمادية غير تامة التطور وثلاث طبقات أو طبقتين من الخلايا البرانشيمية الإسفنجية. وفى بعض النباتات مثل Vaccinium corymbosum كانت طبقة الميزوفيل مكونة من طبقة أو طبقتين من الخلايا الإسفنجية ذات الفجوات العصارية الكبيرة ومحتوى منخفض من السيتوبلازم مع خلل في تكوين أغشية الكلوروبلاست، وربما زادت المسافات البينية بين تلك الخلايا وهذا الاختلاف يسبب إعاقة في عملية التبادل الغازي 1999 ,.Possilova et al). وقد أشار أيضاً إلى تطور طبقة من الخلايا العمادية في أوراق Brassica oleracea بعد ثلاثة أسابيع من الأقلمة، وبالتالي زاد سمك الورقة عقب الأقلمة مع انخفاض المسافات البيئية. وتوضح النتائج التي تحصل عليها (2000) Serret & Trilla من الدراسة المورفولوجية والتشريحية لأوراق نبيتات Gardenia jasminoides الناتجة من زراعة الأنسجة أن هذه الاختلافات تتأثر بتركيز السكر في البيئة بالإضافة إلى شدة الإضاءة المستعملة. وقد أوضحت النتائج أن الخلايا الحارسة كان بها عدد أقل من الريبوسومات والميتاكوندريا والبلاستيدات الغنية بالنشا وعدد من الفجوات العصارية كما أوضحها (2000) Serret & Trillas في الجدولين رقم (3) و (4). ويبين & Mohamed) (2010 ,Alsadon أن خفض تركيز السكر إلى 2% مع استخدام أوعية تسمح بالتهوية يشجع الحصول على تركيب تشريحي لأوراق البطاطس يشابه تلك النامية في البيت المحمي، مما يحسن من الأقلمة.

3. طبقة الكيوتيكل

وهو عبارة عن الطبقة السطحية اللاخلوية لأنسجة النبات ويتم إفرازها بواسطة خلايا البشرة وتتركب من حشوه من الكيوتين منغمس بها الشمع لتغطى سطح النبات. والدور الأساسي لهذه الطبقة هو الحد من فقد الماء بالنتح من أسطح النبات والذي يتأثر معدله بسمك وتركيب هذه الطبقة. ويعتبر التركيب الفقير لهذه الطبقة وعدم اتصالها على سطح الأنسجة من أهم العوامل التي تسبب سرعة فقد الماء أثناء الأقلمة Hazarika er (2002) .al. وقد وجد انخفاض كبير في التركيب البلوري لطبقة الكيوتيكل للنباتات المعملية بالمقارنة مع تلك في البيت المحمي.

جدول 3: تأثير تركيز السكر وشدة الإضاءة على بعض الصفات التشريحية لأوراق نبيتات Gardenia jasminoides الناتجة من زراعة الأنسجة Serret & Trilla (2000).

جدول 4: تأثير تركيز السكر وشدة الإضاءة على بعض الصفات التشريحية لأوراق نبيتات Gardenia jasminoides الناتجة من زراعة الأنسجة Serret & Trilla (2000).

لكن هناك بعض الاستثناءات التي لم يلاحظ فيها فرق في تكوين الكيوتيكل بين النباتات المعملية وتلك في البيوت المحمية (2007) .Pospišilova et al). وبخفض الرطوبة النسبية في أوعية الزراعة والتي تصل في الحالات العادية إلى 98 - 100 % حيث تلاحظ قطرات الماء على الأسطح الداخلية يزيد معدل تكوين الكيوتيكل وبالتالي الأقلمة. وهناك العديد من المعاملات التي تتبع للحد من ارتفاع الرطوبة داخل القوارير وللحد من فقد الماء بالنتح عند الأقلمة ومن هذه المعاملات التي أوردها Hazarika (2003) فيما يلي:

أ. استخدام معوقات النمو: استخدمت معوقات النمو بنجاح في بعض الدراسات لزيادة معدل الأقلمة وذلك لتأثيرها على معدل فقد الماء من البادرات. وتعمل معوقات النمو غالباً على تقصير طول السلاميات وصغر حجم الأوراق وزيادة معدل اللون الأخضر في الأوراق، كذلك يزيد سمك الجذور عقب المعاملة بمعوقات النمو. وباستعراض العديد من الدراسات حول استخدام معوقات النمو في أقلمة النباتات يري (2003) Hazarika أن تلك المركبات يمكنها أن تقلل الضرر الراجع للذبول أثناء الأقلمة، وبدون تأثير سلبي على النمو. فمعاملة نباتات Malus domestica بمركب Paclobutrazol وهو من معوقات النمو التي تستخدم بنجاح مع العديد من النباتات ثبطت إنزيم kaurene oxidase وبالتالي منعت أكسدة ent-kaurene إلى حامض ent-kaurenoic ومن ثم وقف تخليق حامض الجبريلك. وقد أدت إضافة pclobutrazol بتركيز 0.5-4 ملجم/ لتر إلى بيئة تجذير Chrysanthemum إلى خفض في فتحات الثغور وزيادة الطبقة الشمعية على الأوراق مع زيادة تركيز الكلورفيل بها، وتقصير الساق، وزيادة سمك الجذور وكان من شأن ذلك خفض معدل الذبول عند الأقلمة. وأمكن الحصول على نتائج مشابهه في العديد من النباتات منها عدة أنواع من الحمضيات والورد. وبمعاملة شتلات التفاح بمركب paclobutrazol زاد تركيز الكربوهيدرات والكلورفيل والبروتينات الذائبة والعديد من العناصر المعدنية في أنسجة الأوراق وقل تركيز السكريات العديدة في الجدر الخلوية وفقد الماء. وصاحب ذلك زيادة في معدل تنفس الجذور وتراكم حامض الأبسيسك & 1985 ,.Steffens et al) (1987 ,.Wang et al . لكن استجابة الشتلات العادية لمعوقات النمو أعلى من النباتات الناتجة من الإكثار الدقيق وذلك لقلة عدد الجذور والشعيرات الجذرية مما يقلل من معدل امتصاص تلك المركبات من وسط النمو.

ب . استخدام مضادات النتح: يشير (2003) Hazarika إلى دور بعض مضادات النتح في أقلمة النباتات لكن كانت نتائج استعمالها متعارضة بين التأثير الإيجابي والسلبي الراجع إلى تأثيرها على عملية البناء الضوئي والسمية الضوئية. بينما كان لتغطية أوراق العديد من العشبيات ببعض المواد كالجلسرول وشمع البارافين والزيوت تأثير في خفض معدل النتح عند الأقلمة، لكن لم تجرب على مستوى النباتات الخشبية. وأمكن خفض معدل نتح أوراق cauliflower عند رشها بتركيز 10 مكرومول من حامض الأبسيسك، لكن لم يلاحظ فرق كبير في معدل النتح للأوراق التي تكونت عقب الأقلمة وربما يتأثر فعل هذا الحامض بدرجات الحرارة. قفلت 56% من ثغور بادرات التفاح في مزارع الأنسجة بعد 4 ساعات من المعاملة بالمانيتول. وبعد ساعة واحدة من المعاملة بمركب folicote ومن ثم زاد معدل الأقلمة مقارنة مع الأقلمة تحت رزاز من الماء.

ج. خفض الرطوبة النسبية : من الثابت تعرض النباتات التي تتطور في قوارير ذات رطوبة نسبية منخفضة لمشاكل أقل عند أقلمتها حيث يكون التركيب التشريحي والوظيفي أقرب للحالة الطبيعية. ومن العوامل الفعالة في تحسين التركيب التشريحي للأوراق هو خفض الرطوبة النسبية في القوارير لتماثل تلك في غرفة النمو. وهناك العديد من المعاملات لتحقيق ذلك منها استعمال بعض المواد ذات الميل العالي لامتصاص الرطوبة وتغطية سطح البيئة بمواد زيتية لوقف البخر منها. لكن لاحظ (1983) .Wardle et al موت الكثير من النباتات chrysanthemum وانخفاض معدل تكوين الجذور عند تغطية سطح البيئة بزيت lanolin أو استعمال السليكا جيل لخفض الرطوبة في القوارير. وينصح البعض بفتح الأوعية تحت ظروف التعقيم لبعض الوقت الذي يزداد تدريجياً لعدة أيام قبيل الأقلمة. كما أن لتبريد قاعدة القوارير تأثير إيجابي في خفض درجة حرارة البيئة وبالتالي الحد من تبخر الماء منها. وكما سبقت الإشارة فإن كثير من الدراسات تشير إلى الدور الفعال للأغطية التي تسمح بالتبادل الغازي وخروج الرطوبة في نجاح الأقلمة. كما تشير إلى إمكانية خفض الرطوبة في قوارير زراعة القرنفل والتي قدرها بـ 85% بزيادة تركيز السكر أو الآجار وكذلك باستعمال بعض المركبات المؤثرة في الضغط الأسموزي مثل البولي إثيلين جليكول. وقد زاد معدل تكوين الأشطاء بإضافة تلك المواد (1983 ,Leshem).

يتضح مما سبق ضرورة الاهتمام بعملية أقلمة النبيتات عند نقلها خارج المعمل حتى يمكنها التأقلم مع التغيرات البيئة الجديدة. وبالرغم من اختلاف عملية الأقلمة بين النباتات المختلفة فهناك بعض الاحتياطات العامة لرفع نسبة نجاح الأقلمة والتي يمكن حصرها فيما يلي:

1. تكوين على الأقل مبادئ الجذور في بيئة سائلة قبل النقل مباشرة.

2. خفض الرطوبة في الأوعية المحتوية على النبيتات باستخدام أغطية منفذه للبخار أو تبريد القاعدة. وقد تترك الأغطية مفتوحة جزئيا في جو معقم وليكن كابينة الزراعة لخفض الرطوبة النسبية. لكن يعاب على كل هذه المعاملات جفاف البيئة مما يعيق سحب الجذور منها دون حدوث ضرر.

3. يمكن الإقلال من معدل فقد الماء من النبيتات بمعاملتها ببعض المواد مثل Paclobutrazol, ABA, IPA أو BAP. أو ترش ببعض المواد المقللة للنتح مثل Clear spray, DC200, Exhalt 4-10, Folicote, protec Aquawittess

4. إزالة البيئة العالقة حول الجذور لأنها وسط ملائم لنمو الكائنات الدقيقة. مع ملاحظة عدم إحداث ضرر بالجذور المتكونة بقدر الإمكان ويمكن إجراء ذلك تحت تيار بطيء من الماء.

5. إزالة بعض الأوراق المتكونة للحد من فقد الماء ودفع النباتات لتكوين أوراق جديدة للقيام بالبناء الضوئي.

6. معاملة الأفرع ببعض الأوكسينات لتشجيع تكوين الجذور عقب النقل.

7. تزرع النبيتات في تربة جيدة يتم نخلها حتى نضمن نعومتها أو تستعمل تربة صناعية مثل الفيرموكيوليت أو البيتموس ويفضل تعقيم التربة بالبخار أو أشعة جاما قبل النقل على أن توضع هذه التربة في أصص مثقبة من أسفل.

8. تعامل النباتات بالمبيدات الفطرية لمقاومة فطريات الذبول.

9. تحتاج بعض النباتات خاصة الأبصال وبعض الأشجار والشجيرات إلى معاملة بالبرودة على درجة 5 م لمدة 4 - 8 أسابيع لكسر طور السكون.

10. النباتات التي تكون أجزاء أرضية تستعمل للتكاثر مثل البطاطس والداليا يفضل نقلها على هذه الصورة لتحسين نسبة نجاح الأقلمة.

11. يفضل رفع نسبة ثاني أكسيد الكربون لو أمكن حيث يسرع ذلك من دفع النباتات للقيام بالبناء الضوئي وتحولها من نباتات غير ذاتية التغذية إلى ذاتية التغذية.

12. توضع الأصص في وعاء أكبر مملوء بالماء وتغطى النباتات والوعاء المحتوى على الماء بغطاء بلاستيك ليضمن مستوى عالي من الرطوبة النسبية.

13. تقلل الكثافة الضوئية باستعمال قماش على الأقل في الأيام الأولى من الأقلمة على أن ترفع الكثافة الضوئية تدريجياً. حيث تسبب الزيادة المفاجئة في شدة الإضاءة تثبيط ضوئي وربما يحدث تكسير للكلورفيل Van Huylenbroeck et al., 1995 & 200

14. رفع الغطاء البلاستيكي تدريجيا بعد عدة أيام وقد يتم ذلك بإحداث ثقوب يزاد عددها تدريجيا إلى أن يزال الغطاء كلياً.

15. بعد ذلك يتم نقل النباتات من الوعاء المحتوي على الماء وتزرع في بيتموس أو تربة عادية.

يتضح مما سبق أن جل المحاولات لرفع معدل أقلمة النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة كان في تحوير الظروف البيئية في القوارير وكذلك في البيت المحمي. لكن في السنوات الأخيرة أشارت الكثير من الدراسات إلى دور الفطريات التكافلية المعروفة بـ (arbuscular mycorrhizal (AMF في زيادة معدل الأقلمة وتحسين نمو وتطور العديد من النباتات عقب الأقلمة التي تمت في فترة أقل. وقد ذكر (2008) .Kapoor et al العشرات من النباتات ما بين أشجار وحوليات التي تم تلقيحها بـ AMF عند الأقلمة. وتضم AFM العديد من أنواع الفطريات Glomeromycota phylum التي توجد في التربة وتكون علاقة تكافلية مع جذور ما يقرب من 80% من النباتات أغلبها من مغطيات البذور. ويقوم الفطر بإرسال الهيفات إلى داخل الخلايا النباتية للحصول على الكربون بينما ينتشر باقي الفطر خارج النبات في التربة لامتصاص الماء والعناصر المعدنية منها وتهدف هذه العلاقة إلى حصول الفطر على الكربون من النبات بينما يقوم الفطر بمد النبات بالفسفور وبعض العناصر الأخرى كما أنها تزيد مع تحمل النبات لبعض عوامل الإجهاد الحيوي والبيئي وبذلك تحقق العديد من الفوائد سواء للنبات أو للبيئة. ونظرا للفروق الجوهرية بين الظروف البيئة في القوارير والبيت المحمي وكذلك للتباين بين مواصفات النباتات الناتجة في القوارير وتلك النامية في البيت المحمي فإن تلقيح النباتات بهذه الفطريات عند بدء الأقلمة أو قبل نقلها من القوارير يرفع معدل الأقلمة (1998) .Puthur et al و (1999) .Yano-Melo e t al ويزيد من قوة النمو بتنشيط نمو المجموع الجذري وزيادة كفاءة البناء الضوئي وخفض معدل النتح وامتصاص الماء والعناصر من التربة (1996 ,.Azcon-Aguilar et al) و Jaizme-Vega et al (2003). وقد سجل (2000) .Estrada-Luna et al زيادة في معدلات النمو وكفاءة عمل الثغور ومحتوى نبات Psidium guajava من الفوسفور والماغنسيوم والنحاس عند نجاح تلقيحها بفطريات AMF عند أقلمتها.

ويفضل التلقيح باستعمال هيفات الفطر وليس الجراثيم حيث يلاحظ اختراقها للجذور خلال فترة قصيرة قد تكون ساعات على العكس من الجراثيم التي قد تستغرق أسابيع لإحداث العلاقة. لكن هناك العديد من المشكلات التي تعيق عملية تلقيح النباتات أثناء نموها في القوارير بهذه الفطريات ومنها التلوث عند إضافة اللقاح وطبيعة نمو العلاقة الإجبارية التطفل للفطر وكذلك لبعض الاختلافات الفسيولوجية أثناء نمو النبات في القوارير (2001) Rai) . ومن ثم فإن أغلب الدراسات تعتمد على التلقيح بجراثيم الفطر عند نقل النباتات إلى البيت المحمي وعلى الرغم من اعتبار العلاقة بين النبات و AMF غير متخصصة فإنها تتوقف على بعض العوامل الفسيولوجية والتركيبية للنبات والفطر التي تتباين بشدة مما يسبب عدم تكوين العلاقة بين الفطر والنبات. لكن يعيق التطبيق الواسع للتلقيح بهذه الفطريات صعوبة الإنتاج الكمي لللقاح.

وفي النهاية لا بد من توضيح أن نقل وتسويق النباتات الناتجة من مزارع الأنسجة إلى مكان الزراعة المستديم أو إلى المستهلك يتطلب عناية خاصة، وقد يفقد الكثير من النباتات أثناء عملية التسويق خاصا إذا لم يتم أقلمة النباتات لوقت كافي في البيت المحمي بعد نقلها من المعمل تحت دافع تقليل التكاليف. ولذا ينصح في الشركات التجارية تخصيص مكان مستقل لإجراء عملية التغليف والتسويق وغالباً يتم أقلمة نباتات الموز الناتجة من مزارع الأنسجة في أكياس بلاستيكية سوداء اللون ويساعد ذلك على نقلها للتربة بنجاح في المكان المستديم. ويجب اختيار مواد تغليف تتناسب مع درجات الحرارة والرطوبة التي ستتعرض لها النباتات أثناء عملية النقل. ولا شك أن ذلك يرتبط بنوعية النباتات فعلى سبيل المثال يمكن تغليف 40000 نبات lily في طرد يزن 22 كجم بينما لا يمكن تغليف سوى نصف هذا العدد من نباتات Spathiphyllum أو 10000 فقط من نباتات Syngonium بينما ينخفض هذا العدد إلى 7000 نبات Cordyline ويرجع ذلك إلى اختلاف معدل التنفس في تلك النباتات وبالتالي كمية الحرارة الناتجة منه (2004 ,Ahloowalia &Prakash). إذا كانت النباتات ستنقل في المناطق الحارة فيفضل استعمال مواد خافضة للحرارة مثل الثلج والثلج الجاف.