مراحل زراعة الأنسجة وبعض العوامل المؤثرة عليها

حدد Murashige ثلاث مراحل لعملية زراعة الأنسجة وقد لاقى هذا التقسيم قبولا لدى المهتمين بعلم الإكثار الدقيق، لأنه لا يصف فقط مراحل زراعة الأنسجة لكنه يحدد النقاط التي يجب عندها تغيير ظروف النمو لتحقيق الهدف المرغوب من المزرعة. وبعد فترة من نشر Murashige هذا التقسيم تم إضافة مرحلتين جديدتين الأولى قبل تلك المراحل الثلاثة والأخرى في نهاية تلك المراحل فأصبح عددها خمسة. وتختلف الاحتياجات الضرورية لاستيفاء متطلبات كل مرحلة باختلاف نوع المزرعة ونوع النبات، وعوامل أخرى تتعلق بالنبات الأم والمُستأصل النباتي. ويلاحظ أيضاً أن هذه المراحل قد تتداخل مع بعضها البعض وقد لا تتضح كل المراحل في بعض أنواع المزارع (1993 George). ويبين شكل رقم (1) مراحل إنتاج نباتات الخيار بزراعة الأنسجة كنموذج للإكثار المعملي، وتلك المراحل هي:

1. المرحلة الأولى: اختيار وتجهيز النبات الأم

وقد يطلق عليها مرحلة الإعداد وأيضا المرحلة صفر ، فقبل البدء في زراعة الأنسجة يجب الاهتمام باختيار النبات الأم المستعمل كمصدر للمُستأصل النباتي بدقة. فلابد أن يكون النبات مطابق في صفاته للصنف أو النوع المراد إكثاره، وخالي من الأعراض المرضية المختلفة والإصابات الحشرية. وقد تتم معاملة النبات الأم أو الجزء المستعمل كمصدر للأنسجة في هذه المرحلة ببعض المعاملات التي تهدف إلى خفض التلوث الميكروبي أو تحسين النمو والتكشف في الخطوات التالية. فقد تعامل النباتات ببعض المضادات الحيوية أو المبيدات الفطرية. ويشير (2001) Leiert & Casesells إلى أهمية إجراء اختبار معامل المرض لبعض المسببات المرضية. ولعل من الضروري مقاومة الحشرات لأنها ناقل أساسي للكثير من الجراثيم وبعضها قد يضع البيض داخل أنسجة النبات ليفقس عقب تأسيس المزرعة والإعداد الجيد في هذه المرحلة يرفع من نسبة نجاح المزرعة ويقلل من تكاليف الإنتاج.

2. المرحلة الثانية: تأسيس المزرعة المعقمة

بعد اختيار النسيج المناسب وإعداده الإعداد الجيد تأتى الخطوة التالية ذات الأهمية القصوى في زراعة الأنسجة ألا وهي عزل المستأصل من النبات وتعقيمه تعقيما سطحياً للتخلص من التلوث السطحي وبدون التأثير على حيوية النسيج. ثم ينقل المُستأصل إلى الوسط الغذائي الملائم الخالي من مظاهر التلوث. ويترتب على ذلك غالباً نمو المستأصل النباتي بإحدى الصور المختلفة للنمو كالزيادة في الحجم أو تكوين الكالس أو الأجنة الجسدية وأي نسيج أو بيئة تصاب بتلوث في هذه المرحلة يجب استبعاد الوعاء المحتوى عليه وتعقيمه قبل التخلص منه، وغالباً يمكن التحقق من وجود التلوث بعد 3-5 أيام من الزراعة. ويقاس نجاح هذه المرحلة بمدى الحصول على أنسجة غير ملوثة لها القدرة على مواصلة النمو.

3. المرحلة الثالثة: استيلاد النباتات

الهدف من هذه المرحلة هو تكوين أفراد جديدة من المُستأصل النباتي أو ما يعرف باستيلاد نباتات جديدة. وهذه النبيتات plantlets يمكن فصلها من المزرعة ونقلها إلى وسط جديد حيث تستمر في النمو وتعطى نباتا كاملا، تتعدد صور نشوء تلك النبيتات فقد تكون أفرع تكشفت من براعم موجودة سابقا على النبات الأم أو من براعم عرضية تكونت على المستأصل النباتي. كما تتطور النبيتات أيضاً من الأجنة الجسدية أو من البراعم المتكونة على الأجزاء الخضرية المخزنة للمواد الغذائية كدرينات البطاطس وقد تستعمل النبيتات المستولدة كنسيج يعاد زراعته للحصول على نبيتات جديدة ويمكن تكرار ذلك عديد من المرات مالم يفقد المُستأصل قدرته على التكشف. وفى معظم الحالات تقل بعض المشكلات كإفراز المواد الفينولية التي قد تصادف زراعة النسيج الأول وتسبب فشل المزرعة.

شكل 1: مراحل إنتاج نباتات الخيار باستعمال زراعة الأنسجة (1) مرحلة تأسيس المزرعة، (2 و 3) مرحلة استيلاد النباتات بتكوين البراعم العرضية، (4) مرحلة الإعداد للنقل خارج المعمل، (5) مرحلة أقلمة النباتات للظروف الطبيعية، (6) نبات كامل مزهر بعد الأقلمة.

4. المرحلة الرابعة: الإعداد للنمو في الظروف الطبيعية

تكون النبيتات أو الأفرع الناتجة من المرحلة السابقة صغيرة الحجم ضعيفة التكوين وقدرتها على عملية البناء الضوئي وامتصاص الماء من التربة معدومة أو على الأقل منخفضة بشكل كبير. وليس لهذه النباتات القدرة على النمو في الظروف الطبيعية في البيوت المحمية. لذا فإن هذه المرحلة تتضمن إعداد النبيتات لتتحمل الظروف العادية والقيام بعملية البناء الضوئي. وقد تحتاج بعض النباتات إلى معاملات خاصة فمثلا النبيتات التي لها دور سكون كمعظم الأبصال والكثير من الأشجار الخشبية يجب كسر سكونها سواء بالبرودة أو استعمال بعض منظمات النمو. وقد أقترح ضرورة تكوين الجذور أو منشأتها على الأفرع في هذه المرحلة قبل نقلها إلى خارج المعمل لأن تلك التي تكونت في المرحلة السابقة عادة غير عادية التركيب كما هو موضح بالشكل رقم (2) ولا تقوم بدورها الفسيولوجي. لكن على الرغم من هذا فإن تكوينها مؤشر جيد على إمكانية نجاح نقل النباتات إلى خارج المعمل. وهذه العملية مهمة جدا كجزء من برنامج الإكثار الخضري الدقيق حيث تقدر تكاليف مرحلة تكوين الجذور بحوالي 35-75 % من التكاليف الكلية لبرنامج الإكثار الدقيق (1981 ,Debergh & Maene) .

شكل 2: الجذور العرضية غير العادية في مزارع الأنسجة (على اليسار) والجذور العادية أثناء عملية الأقلمة (على اليمين).

ولا يقتصر الأمر على تكوين الجذور بل من المهم أن يكون هناك ارتباط بين أوعية الخشب في الجذور والسوق. وتكون النباتات العشبية عموما جذوراً بسهولة في برامج الإكثار الدقيق على العكس من الأشجار والشجيرات. وهناك بعض النبيتات كالتين والطماطم تكون جذور دون الحاجة إلى تغيير في مكونات البيئة رغم احتوائها على السيتوكينينات فقط وبدون إجراء معاملات خاصة لدفعها للتجذير. وإذا كانت المزرعة في شكل كتلة من الأشطاء فيجب عدم تقسيمها إلى أشطاء فردية إلا بعد تكوين الجذور. وفي بعض الحالات قد يفضل برنامج الإكثار تماماً لعدم تكوين جذور على النبيتات الناتجة وبالتالي تموت النباتات عقب النقل من المعمل. وإن كانت النباتات الناتجة متقزمة فيجب دفعها للاستطالة باستخدام بعض منظمات النمو. وفي معظم الحالات يجب إتباع خطوات خاصة لدفع عملية التجذير.

ويتم دفع النباتات للتجذير بالمعاملة ببعض الأوكسينات أو نقل الأشطاء إلى بيئة ذات تركيز منخفض من الأملاح كاستعمال نصف أو ربع تركيز أملاح MS. كما يلعب تركيز الأجار والسكر في البيئة وإضافة بعض المركبات عديدة الأمين دورا في عملية التجذير. وقد تمت مقارنة تجذير أفرع نباتات Syzygium altermifolium في بيئة تحتوي على 2% سكر و 0.8 % آجار و 10 ملجم/ لتر IBA وباستعمال تركيز من أملاح MS يتراوح بين صفر والتركيز الكامل، وأشارت نتائجSha Valli-Khan et al (1999)  والموضحة بالجدول التالي إلى تأثير ذلك على النسبة المئوية للتجذير وعدد الجذور وطولها. وقد لاحظ أهمية تركيز أملاح البيئة أثناء تكوين الجذور فلم تتكشف أي جذور في حالة عدم إضافتها فضلا عن اصفرار الأوراق. وكان التركيز المنخفض منها وهو ربع MS أفضل من التركيزات الأعلى. كذلك كانت البيئة شبة الصلبة أفضل من البيئة السائلة لتكوين ونمو الجذور حيث زاد عدد الجذور والنسبة المئوية للتجذير وطول الجذر بزيادة تركيز الأجار من صفر إلى 0.8 %، لكن انخفضت قيم قياسات جميع هذه الصفات بزيادة تركيز الآجار عن 0.8%. وكان أفضل تركيز للسكر هو 3% حيث زادت النسبة المئوية للتجذير وعدد الجذور ومتوسط طول الجدور المتكونة زيادة طردية بزيادة تركيز السكر من 1 - 3 % أما التركيزات الأعلى 4 - 5% فقد أعطت تاثير مسبب مضى هذه الصفات.

جدول يبين: تأثير تركيز أملاح MS على تجذير أفرع نباتات Syzygium alternifolium كما سجلها (1999) .Sha Valli-Khan et al.

ويشير (1997) .Arrebola et al إلى إمكانية نقل الأشطاء المتكشفة في القوارير معمليا لنباتات Isoplexis canariensis إلى خارج المعمل بدون تكوين جذور وقد حصل على نسبة أقلمة تصل إلى 100 % باستبدال البيئة التي استعملها في أوعية الزراعة أثناء مرحلة التضاعف ببت موس معقم وتم الري بالماء المعقم لمدة 8 أسابيع. وقد حفظت المزرعة خلال هذه الفترة في نفس غرفة الزراعة لكن برفع الرطوبة النسبية إلى 90-100 %. نقلت الأشطاء بعد ذلك إلى صواني زراعة مملوءة بالبيت موس في البيت المحمي على درجة حرارة 25 م ورطوبة نسبية 50%. ثم نقلت الأشطاء بعد ذلك بصور فردية إلى أصص وكانت درجة الحرارة أثناء النهار 15 م وخلال الليل 3 م والرطوبة النسبية 40%. وفى بعض المعامل التجارية تتم عملية التجذير خارج المعمل عقب استطالة الأفرع وذلك لتقليل تكاليف الإنتاج. فعلى سبيل المثال استطاع (2002) .Bhatia et al الحصول على نسبة تجذير 100 % عند الإكثار الدقيق لنبات Stackhousia tryonii بغمس قواعد العقل الطرفية بعد غسل البيئة العالقة عليها في محلول 2 ملجم/ لتر IBA ثم زراعتها في تربة مكونة من الرمل والبيرليت بنسبة 4 : 1 وحفظها في غرفة مشبعة بالضباب ودرجة حرارة 32 م لمدة أربعة أسابيع.

5- المرحلة الخامسة : النقل للظروف الطبيعية

يعتبر نقل النبيتات من المعمل إلى البيت المحمي أو الحقل وهو ما يعرف بالأقلمة acclimatization أو adaptation عنق الزجاجة في نجاح برنامج الإكثار الدقيق.